第二章食品微生物鉴技术和方法.pptVIP

微生物的分离、纯化与接种技术 微生物的分离、纯化与接种技术 检测食品中微生物总数的方法 4种基本方法： （1）标准平板计数或好氧平板计数，适用于活细胞或菌落形成单位。 （2）最大可能值法。作为一种统计学的方法来测定活性细胞。 （3）染色还原技术。估计拥有还原能力的活性细胞数目。 （4）直接显微镜计数法。活性和非活性细胞。 检测食品中微生物总数的方法 常规的标准平板计数（SPC） 将一部分食品样品混合或者均质化，在适当的稀释液中进行梯度稀释，然后涂布或者倾注到适宜的琼脂培养基上，在适当的温度下培养一段时间后，使用电子计数器对可见的菌落进行计数。 SPC法是目前测定活细胞数和食品产品中菌落形成单位数最广泛的方法。 常规的标准平板计数（SPC） 记录产品中全部活细胞时，要考虑以下因素： 1）采用的取样方法 2）食品样品中有机体的分类 3）食品生物区系的种类 4）食品原料的种类 5）食品产品的预检历史记录 6）所用培养基的营养程度 7）所用的培养温度和时间 8）pH值、aw和培养基的氧化还原电位 9）所用的稀释液类型 10）食品样品中有机体的相对数量 11）竞争或拮抗有机体的存在 检测食品中微生物总数的方法 显微镜菌落计数法 是通过显微镜对载玻片琼脂层上生长的微小菌落计数。首先进行涂布，将0.1ml的牛乳琼脂混合物涂布到4cm2的载玻片上，经培养，干燥和染色，借助显微镜对微小菌落进行计数。 另一种方法是将2ml融化的琼脂与2ml热牛乳混合，随后取0.1ml已经接种的琼脂涂抹到4 4cm2的载玻片上，最后用硫堇蓝染色，用16mm物镜的宽视野显微镜观察载玻片。 检测食品中微生物总数的方法 最大可能数法 在这种方法中，食品样品的稀释液的准备类似于SPC法。将三个连续等分量样品或稀释梯度的稀释液转移到9个或15个有适宜培养基的试管中，分别称为3试管或5试管法。 最初样品中微生物的数量通过查阅标准MPN表来获得。通常MPN法的结果高于SPC的结果。 检测食品中微生物总数的方法 MPN法的优点： （1）这种方法相对比较简单 （2）与SPC法相比，不同实验室得到的结果更加可靠，相似率较高。 （3）特殊微生物群体可以通过适当的选择性培养基进行测定。 （4）这是一种测定粪大肠杆菌群含量的方法。 缺点：精确度低。 检测食品中微生物总数的方法 染色还原试验 在估测相关产品中活菌数量时，通常使用两种染色剂：亚甲基蓝和刃天青。 进行染色还原实验时，食品上清液加入任何一种染色剂标准溶液，亚甲蓝会从蓝色还原为白色，而刃天青则从暗蓝色还原为粉红色或白色，染色剂还原的时间与样品中微生物的数量成正比。 染色还原试验 刃天青还原反应快速检测牛肉腐败，被还原为无色、有味、而且结果与SPC法显著相关。 乳品中用来估测鲜牛乳的微生物学质量，简单，快捷，经济，而且只有活细胞才对显色剂有明显的还原能力。 缺点：微生物对染色剂的还原程度不同，不适用于含还原酶的食品。 食品表面微生物的检测 1.棉拭/棉拭漂洗法 是表面微生物检验中最古老、应用最广泛的方法，它不仅应用于食品及乳制品，而且还用于医院、饭店。 方法：将1.5ml液体加到平整的表面上，在3cm2区域内擦拭15s，然后用微升移液管取0.1ml和0.5ml液体，将液体在平板计数琼脂或选择性培养基上涂布或倒平板计数。 食品表面微生物的检测 2.接触平板法 平板直接接触复制微生物法（RODAC）使用一种特殊的皮氏培养皿，平板中倾倒15.5－16.5ml培养基，形成琼脂平面；当把平皿倒置时，凝固的琼脂就会与待测表面直接接触，接触后盖上平皿盖、培养，然后进行菌落计数。 缺点：仅适用于菌落较分散的表面，对于污染较严重的表面无效。 食品表面微生物的检测 3.琼脂注射/琼脂肠法 琼脂注射法：将1个100ml的注射器去掉针头，改造成中空的柱体，并在中空的部分注入琼脂，通过推动活塞将琼脂从柱体底部挤压到待测表面上，将露在外面的那层切下，置于皮氏平皿中，经过培养后进行菌落计数。 琼脂肠法：与注射法类似，只不过用的是塑料试管而不是改造的注射器。 广泛用于肉制品或食品加工设备表面微生物的检测。 缺点同RODAC法，适合菌落分散和表面污染程度较轻的样品。 其他检测方法： 1）直接表面检测法 2）粘性薄膜法 3）棉拭/琼脂斜面 4）超声波装置 5）喷雾枪法 制备核酸探针要注意两个关键性的问题： 1. 要选择特异性强而又无交叉反应的核酸(DNA或RNA)片段，可通过核酸重组和克隆以及人工合成、PCR扩增等技术获得 2. 标记物，当前常用同位素(32P、35S等）、光生物素