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液相色谱基础知识 戴安中国HPLC销售培训 2005年 关于色谱 色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等 色谱法简介 色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代 色谱的发明人 俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献 色谱分离的机理 什么是液相色谱 什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段 HPLC的仪器配置及流程 HPLC的仪器配置及流程 色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram） 液相色谱图相关术语 色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 － Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离 液相色谱图相关术语 峰面积 － Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差；σ － Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 － Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 － Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 － Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰 液相色谱图相关术语 基线 － Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 － Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N － Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象 液相色谱图相关术语 死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR － Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 － Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR － Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 液相色谱应用：制备型液相色谱 分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求 化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速 液相色谱应用：分析型液相色谱 定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用 液相色谱原理 － 基本概念及方法开发 液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件 评价液相色谱方法的标准 什么是色谱的分离度 影响分离度的因素：K’、α及N 分离度方程： K‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 α是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度 分离度方程解析：柱效项 N ＝ 理论塔板数：分离效率的量度 色谱柱的柱效 N 峰宽与塔板数的关系 塔板数与流速的关系 分离度与 N 的关系 分离度方程解析：分离因子项 ? ＝ 分离因子：峰分离程度的量度 分离因子：α 定义： a =1 时两组分分不开， 改变a的途径 改变固定相或改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质