第七章蛋白质离、纯化.pptVIP

第七章 蛋白质的分离、纯化 蛋白质分离、纯化主要依据 （1）蛋白质的分子大小 透析、超滤、分子筛层析 （2）蛋白质的带电特性 等电点沉淀、离子交换层析、 等电聚焦电泳 （3）蛋白质的溶解特性 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离 蛋白质粗分级 采用简单的实验技术手段，比如盐析、等电点沉淀、透析、超速离心等对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。 四、等电点沉淀法在一定的pH条件下，蛋白质所带的净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。 蛋白质细分级 采用分子筛层析、离子交换层析、亲和层析等手段结合多种电泳技术，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等进一步对蛋白质粗制品分离纯化，以获得高纯度的蛋白质样品，用于蛋白质结构、功能及其应用研究。 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 常用分子筛： 葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP） 凝胶的前处理 样品上柱、洗脱、收集 凝胶的再生及保存 再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷 三、亲和层析 原理： 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的专一识别并结合的特性来分离蛋白质。 配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体. 1．原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N?，N?-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶优点 化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感； 重复性好； 灵敏度高，可达10-6 g； 分辨率高。 实验方法： 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 蛋白质含量测定与蛋白质鉴定  在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。 蛋白质含量测定有很多方法 凯氏定氮法 双缩脲法 福林-酚法 考马斯亮蓝比色法 紫外吸收法 蛋白质鉴定包括很多内容， 蛋白质分子量与等电点的测定 蛋白质氨基酸组成及顺序的分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质生物活性及功能测定 蛋白质含量测定 最经典的蛋白质含量测定方法是凯氏定氮法，其基本依据是蛋白质平均含氮量为16%，假设测得样品中的含氮量为1 g，所有的氮以蛋白质的形式存在，则蛋白质含量为1/16%=6.25 g。 紫外吸收差法是最简单便捷的蛋白质含量测定方法，分别测定样品在280nm和260nm的光吸收值，利用经验公式，蛋白质浓度（mg／mL）＝1.45×A280 nm－0.74×A260 nm，很容易计算出样品的蛋白质含量。 分光光度法是主要的蛋白质含量测定方法，首先将蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量。 蛋白质鉴定 蛋白质鉴定主要包括以下几个方面： 蛋白质纯度鉴定 蛋白质分子量及等电点测定 蛋白质氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴定 蛋白质生物活性及功能测定 （一）蛋白质纯度鉴定： 目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法，电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比来表示目标蛋白的纯度。 （二）蛋白质分子量及等电点测定： 蛋白质分子量测定有多种方法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最常用的方法之一。采用IEF可测定蛋白质等电点。 （三）蛋白质氨基酸组成及顺序分析 1．蛋白质氨基酸组成分析 首先将蛋白质水解为氨基酸，通常情况下采用酸水解，蛋白质水解后的氨基酸混合物可通过全自动氨