活性炭和振荡培养对提高大白菜胚诱导率影响.docVIP

活性炭和振荡培养对提高大白菜胚诱导率影响 　　摘要：以11个大白菜品种(品系)为材料，采用NLN培养基进行游离小孢子培养，研究了活性炭和振荡培养对小孢子胚诱导和形成的影响。结果表明：11个大白菜品种有9个诱导出胚，每花蕾诱导胚数0.056～12.67个。在NLN-13培养基中添加活性炭(0.5g/L)，有利于小孢子胚的诱导和形成，Y536和Y585胚诱导率分别提高了16.1和4.8倍，极难诱导出胚的材料Y516也诱导出胚；采用振荡培养方式(65r/min)，Y531和Y445胚诱导率较静置培养分别提高了18.23％和30.91％，出胚时间提早2～4d。 　　关键词：大白菜；游离小孢子培养；小孢子胚；诱导率；活性炭；振荡培养 　　 　　双单倍体(DH)纯系材料在蔬菜育种中具有重要应用价值。游离小孢子培养(IMC)是快速获得DH纯系的一种有效方法，与常规多代自交获得纯系相比，具有周期短、效率高、纯系稳定等特点。在芸薹属作物中，先后对油菜、芥菜、大白菜、小白菜、甘蓝和芜菁等进行了游离小孢子培养并获得了再生植株。国内外学者对影响大白菜游离小孢子培养的某些因素(基因型、培养基、供体植株的生长条件、高温预处理等)进行了研究，通过优化培养基和改进培养方法，使部分材料小孢子胚产量有了明显的提高。但一些难诱导的材料胚产量低而不稳定，限制了该方法在生产中的应用。笔者利用在培养基中添加活性炭和采用振荡培养的方法，对大白菜游离小孢子培养胚的诱导和形成进行了研究，获得了较理想的效果。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　材料 　　试验于2005年9月至2007年10月在河南省农业科学院园艺研究所蔬菜研究室进行。供试材料为来自不同省市的11个大白菜品种或自交系。材料类型具有广泛的代表性。各材料在前1年秋季将种子播于大田，自然越冬后于第2年春季3月10日至4月20日进行培养。 　　 　　1.2　培养基 　　游离小孢子培养提取冲洗液采用B5基本培养基，蔗糖浓度13％，pH值5.8，高压灭菌。小孢子培养液采用NLN基本培养基，蔗糖浓度13％，pH值5.8，用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，过滤液分装到三角瓶中。每瓶20～30mL，备用。 　　 　　1.3　方法 　　从供体植株主花序或顶部分枝花序上取2.0～4.0mm长花蕾，在显微镜下镜检小孢子确定发育时期，选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾(2.0～3.0mm)，用75％酒精浸30s，0.1％HgCl2消毒5min，无菌水冲洗3次以上。然后将花蕾置入10mL试管中，加入Keller-13冲洗液3～5mL，用玻棒挤破花蕾散出小孢子，将小孢子悬浮液用400目滤网过滤，收集滤液在600r/min下离心3min，沉降小孢子，弃去上清液。再加入Keller-13冲洗液，重新悬浮小孢子。离心重复3次。最后加入NLN-13培养液，用血球计数板计数，调整小孢子浓度为1×105个/mL。将小孢子悬浮液分装至60mm×15mm培养皿中，每皿2mL，用Parafilm膜封口。小孢子先放入33℃恒温培养箱中高温培养24h，然后转入25℃下黑暗培养，每天取少量材料观察小孢子分裂情况和形成小细胞团数目。培养30d后统计小孢子胚数目。 　　诱导率(胚/蕾)=诱导小孢子胚数/培养花蕾数 　　1.3.1　基因型比较　采用笔者报道的方法，以添加13％蔗糖的NLN液体培养液为基本培养基，其他培养条件均一致，比较不同基因型对小孢子胚诱导率的影响。 　　1.3.2　活性炭处理　选取胚诱导率高低不同3个基因型材料(Y531、Y516、Y536)，每个材料均分2组处理。1组处理中加入0.5g/L活性炭，另1组不加。比较活性炭对小孢子胚诱导的影响。 　　1.3.3　培养方式　选取胚诱导率不同的Y531、Y445和95-12 3个基因型材料，每个材料分别进行振荡培养和静置培养，振荡培养频率65r/min，比较不同培养方式对小孢子胚诱导的影响。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2.1　不同基因型大白菜胚诱导率比较 　　试验结果表明，在供试的11个基因型材料中有9个诱导形成了小孢子胚，材料诱导成功率达81.8％。不同基因型材料间胚诱导率差别极大，最高的Y191每花蕾诱导胚(诱导率)12.67个；较低的Y516每花蕾诱导胚0.056个，二者相差226倍。而自交系ZY15和72049均未诱导出小孢子胚，其原因有待研究。从培养结果可以将大白菜区分为易诱导、胚产量高的基因型与难诱导、胚产量低的基因型。其中，Y191、Y360、Y531、Y536、95-12、58为易诱导基因型，每花蕾诱导胚在1个以上；而Y585、Y445、Y516、ZY15、72049为难诱导基因型材料，每花蕾诱导胚在1个以下，表明基因型是