5分子生物学研究法上——DNARNA及蛋.ppt

Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。 下图为用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。 为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。 TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。 随着PCR反应的进行，TaqMan探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。 5、基因组DNA文库构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。 构建基因组文库最常用的是λ噬菌体载体（克隆能力约15-20kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的λ噬菌体载体上。 此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。 它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。 5.3 RNA基本操作技术 真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。 细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。 一个典型的动物细胞约含10-5μg RNA，其中： 80%-85%为rRNA 15%-20%为tRNA及sRNA mRNA约占总RNA 的1%-5% rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。 RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。 PolyAT tract mRNA的分离纯化过程简图 由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我复制的载体中。 左图为cDNA合成过程示意图 定向cDNA合成及分子修饰 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。 cDNA文库的构建 cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。 cDNA文库常用Uni-zap XR（一种λ噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。 重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。 基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。 核酸杂交法： 核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。 将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。 取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。 80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。 PCR筛选法 将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。