活性氧自由基在试验性乳腺炎大鼠发病机制中作用.docVIP

活性氧自由基在试验性乳腺炎大鼠发病机制中作用 　　摘要：为探讨活性氧自由基在宿主抵抗乳腺感染中的作用，选取36只清洁级SD怀孕大鼠，于产后72 h经乳头管灌注10 μg/侧脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）至第4对乳腺（两侧）内。分别于灌注前（定义为0 h）及灌注后2、4、8、16、24 h（n=6）颈静脉放血处死动物，采集样品。结果显示，LPS诱发乳腺炎引起白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达显著升高，从而促进嗜中性粒细胞（neutrophil，PMN）迁徙及活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的释放。乳腺组织N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase）活力与ROS释放变化结果一致，LPS灌注后各时间点均显著升高，并于灌注后8 h达到峰值。结果表明，PMN是宿主抵御乳腺感染的主要效应细胞，通过释放ROS消灭病原菌，但大量释放的ROS也是引起组织损伤的重要原因。 　　关键词：活性氧；中性粒细胞；乳腺炎；大鼠 　　中图分类号： R979.5文献标志码： 　　文章编号：1002-1302（2016）08-0294-03 　　乳腺炎是危害奶牛产业的一种重要疾病，诱发因素众多，其中以病原菌感染最为严重。目前，临床上分离的乳腺炎致病菌超过137种，根据病原来源和传播方式可分为传染性病原和环境性病原两大类。大肠杆菌是环境性病原的代表，也是临床型乳腺炎中最常见的类型。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是大肠杆菌细胞壁的组成成分，是大肠杆菌引起炎症反应的主要致病因子。研究表明，LPS诱发的试验性乳腺炎具有炎症反应一致、重复性高的优点，是研究大鼠乳腺炎发病机制的理想模型。 　　病原菌入侵宿主是复杂、动态的多因子作用过程，从病原与宿主互作的角度研究病原侵染后的致病机制，以及从分子水平了解宿主的免疫反应是控制疾病的关键所在。已有研究证实，活化的PMN通过释放大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）杀灭病原微生物，ROS是分子氧在还原过程中的一系列代谢中间产物，主要包括 O-2[KG-2]? [KG-3]、H2O2、HOCl、?OH 等[1-2]。对胞内感染菌的研究发现，ROS的产生对清除胞内微生物是必需的，但持续过度激活产生过量氧化剂，超过局部抗氧化剂的防御反应时会降解蛋白多糖，降低细胞外基质与乳腺上皮的黏附性，引起乳腺上皮细胞死亡、脱落及泌乳功能的损伤[3-4]。深入了解ROS在宿主抗乳腺感染过程中的作用具有重要意义。 　　1材料与方法 　　1.1试验动物 　　36只清洁级怀孕SD大鼠购自上海实验动物中心。于产后72 h诱发试验性乳腺炎，经乳头管注入10 μg/侧LPS至大鼠第4对乳腺（两侧）内。分别于灌注前（定义为0 h）及灌注后2、4、8、16、24 h（n=6）颈静脉放血处死动物，收集血清、肝素抗凝血、乳腺组织用于后续分析。 　　1.2主要试剂与仪器 　　LPS（O55：B5）、乙酸肉豆蔻佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、双氢罗丹明（dihydrorhodamin，DHR 123）均购自Sigma公司。TRIzol购自Invitrogen公司，RNA酶抑制剂、随机引物、M-MLV、dNTPs均购自Promega公司，SYBR Green PCR Master Mix?自Toyobo公司。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）放免试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。 　　FMJ-182型放射免疫γ计数器（中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂），UV755B型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），BH2型光学显微镜（日本奥林巴斯公司），组织匀浆器（瑞士Kinematica AG），核酸浓度测定仪（德国Eppendorf Biophotometer），7300型荧光定量PCR仪（ABI Prism），流式细胞仪（美国BD Biosciences）。 　　1.3测定指标及方法 　　1.3.1组织匀浆及蛋白浓度的测定准确称取1 g乳腺组织加入生理盐水6 mL，冰浴匀浆后于10 000 g 4 ℃离心 30 min，上清液于-20 ℃冰箱保存备用。使用前采用 Br