病毒液质量对除病毒膜验证影响浅谈.docxVIP

病毒液质量对除病毒滤膜验证的影响 ??生物制药企业需要证明在他们的下游工艺中，可以去除在生产过程中可能产生的内源或者外源的病毒。工艺开发工程师通常将哺乳动物病毒加入到蛋白溶液中，对病毒去除步骤（过滤、层析、热处理或化学失活等）进行缩小规模的验证实验。从这个实验可以看出病毒去除的效果，通常我们将4个对数减少值(Log Reduction Values, LRV)定义为有效的病毒去除步骤。??此外，对于除病毒过滤来说，缩小规模除病毒验证还可以确定某些工艺参数，如：操作压力，通量，单位面积滤膜的载量和通量衰减等。当然，这种实验是假定缩小规模实验和大规模生产是在同样条件下为前提的。然而，在实际病毒验证过程中，病毒液的加入可能显著的改变滤膜的性能，从而使病毒验证实验不具有代表性。规范病毒液的制备过程，可减少病毒液对除病毒验证的不良影响，从而使缩小规模实验更接近实际工艺情况。??病毒验证经常选择一些与工艺中可能引入的病毒大小相近的模式病毒。小鼠细小病毒是Parvoviridae家族的一种细小(18~26nm)，无包被的，单链DNA病毒，已在生物制药生产过程被发现的外源污染，特别是在murine hybridoma和CHO表达系统中。由于这种病毒非常小，而且被证明是有可能产生的外源污染，因此MMV经常被用来做病毒截留研究。??噬菌体也经常被应用于病毒截留机制的研究，是因为它比较容易被纯化至高滴度，而且它的检测方法相对简单和快速（通常可在一天内完成）。噬菌体ΦX174是一个直径为25~35nm，无包被的DNA病毒，属于Microviridae。用来作为细小病毒研究。??此外，在单抗生产过程中，经常会用到一些逆转录病毒类似(Retrovirus-like particles, RVLPs)的细胞系，会产生内源污染。Xenotropic murine leukemia virus (X-MuLV)是一种直径为80~110nm的，包被的，单链RNA病毒，属于Retroviridae。这种病毒经常用来作为RVLPs的模式病毒。本文的病毒截留数据均以这三种病毒和Viresolve NFP膜为例。 ??纳滤是从蛋白料液中除去病毒的有效方法，它是以大小排除的机制实现的。病毒验证时通常使用缩小规模设备以生产过程中的参数进行病毒截留实验。如：对于Viresolve NFP膜通常使用Optiscale 25 (约3.5 cm2)。??虽然除病毒实验以缩小规模模拟实际生产为目的，但在某些情况下这种放大实验不一定能反应实际生产情况。比如，在蛋白溶液中加入病毒会导致滤膜提前堵塞，而在实际除病毒验证应用中通常以体积处理量为衡量滤膜处理能力的参数。因此，生产者在生产过程中可能要用到比实际需要更大的滤膜面积。这样就会增加生产者过滤过程中的成本，此外还会因滤膜面积增大而带来的各种问题。???滤膜性能??有许多因素都会影响到滤膜的性能，比如：过滤产品的种类和成分、缓冲液成分、蛋白浓度和纯度、蛋白聚集程度（可能由存放时间、反复冻融和运输等因素影响）等。这些因素都可能影响载量、通量、处理时间和潜在的病毒截留。有许多方法可以帮助使用者理解和减少在病毒截留研究中可能对滤膜性能产生影响的因素。然而，病毒液本身对滤膜性能所产生的影响往往被忽视。病毒液本身可能含有血清中的蛋白、宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和很多脂类。??从治疗用蛋白如单抗中分离细小病毒是相当困难的，因为病原体大小与产品分子大小十分接近。比如IgG分子的流体动力学半径约为8~10nm，而典型的细小病毒直径约为20nm。而事实上，除病毒过滤是要将95%的IgG分子透过膜，同时对细小病毒的截留达到大于4个对数值。因此，这种滤膜对于蛋白聚集物或病毒液中的其他污染物质比较敏感。??图一表示的是病毒液对Viresolve NFP滤膜性能的影响。图中分析了不同条件下过滤时间和滤过体积的情况。我们可以从图中看到过滤单体结构的蛋白溶液，通量随时间几乎没有衰减。当加入含有1% FBS (fetal bovin serum)的MMV病毒粗品时通量衰减显著增加，在加入蛋白聚集体（通过热处理产生）时也出现相似的情况，当两者同时加入时通量衰减会更加明显。如按照下三条曲线所计算得到的滤膜面积会明显增大，大大提高生产成本。 ???很多除病毒过滤实验表明在过滤一定体积料液后病毒有可以产生穿透。对于Viresolve NFP膜来说，研究表明在滤膜通量下降至一定程度，发生堵塞效应时对噬菌体ΦX174的LRV值会下降。在这些研究中，滤饼过滤（用90nm颗粒模拟）基本不会对LRV值产生影响。而蛋白聚集体所产生的堵塞会导致严重的通量衰减，从而使LRV值下降。当用21nm的颗粒进行堵塞实验时LRV值的下降位于两者之间。??因此在病毒截留研究时病毒