PIK3CA和PDK1在喉鳞癌中的表达及意义.pdf

二、免疫组织化学主要仪器、材料、试剂和实验方法 1、主要仪器 E800型双目显微镜 同本nikon公司产 MoticBS显微摄像系统 麦克奥迪实业集团公司 HHBl 1-420型电热恒温箱 上海跃进医疗有限公司 52．93自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 Electron 冰箱Themo Corporation Electron 低温超速离心机Thermo Corporation 计时器 微波炉 孵育盒 移液器 冲洗瓶 2、材料 一次性吸头，EP管，载玻片，盖玻片，冷冻盒，树脂等均为国产产品。 3、实验试剂和药品 兔抗人PIK3CA多克隆抗体 (Cell Signaling公司) (Sata 鼠抗人PDKl多克隆抗体 Cruz公司) 即用型SP免疫组织化学试剂盒 (北京中杉金桥生物科技公司) DAB显色剂(Diaminobenzidine)(北京中杉金桥生物科技公司) 氯化钠 (国药集团化学试剂有限公司) 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 (国药集团化学试剂有限公司) 二水合柠檬酸、三水合柠檬酸 (国药集团化学试剂有限公司) 中性树胶 (国药集团化学试剂有限公司) 苏木素 二甲苯 70％～100％不同浓度的酒精 6 4、实验方法 操作步骤严格按照SP试剂盒说明书进行，具体步骤如下： (1)将4um切片脱蜡水化后，用蒸馏水冲洗，PBS液中浸泡5分钟。 (2)3％过氧化氢去离子水孵育20分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性， PBS冲洗3次，每次3分钟。 (3)用柠檬酸缓冲液(PH=6．0)微波修复，冷却后采取胃蛋白酶行酶修复法 行抗原修复20分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟。 (4)甩去PBS液，每张切片加1滴封闭用J下常山羊血清工作液(试剂A)， 室温下孵育20分钟，倾去，勿沈。 (5)每张切片加1滴适当比例的一抗，4。C冰箱内过夜。 (6)PBS冲洗3次，每次3分钟。 育30分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟。 (8)甩去PBS液，每张切片加1滴辣根每标记链酶卵白素工作液(试剂C)， 37。C孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟。 分钟，阳性显色为棕色。 (10)自来水冲洗，苏木素复染2分钟，蒸馏水冲洗，自来水冲洗返蓝30分 钟。 (11)切片经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。 上述步骤中用试剂公司提供的已知阳性切片作为阳性对照，以PBS缓冲液代 替一抗作为阴性对照，以排除非特异性着色。 三、结果评判标准 采用双盲法，由两位有临床经验的病理科医生对免疫组化结果进行判读。结 果以阳性细胞比例和阳性强度综合评分。PIK