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巴西橡胶树钙调蛋白基因克隆和表达分析 　　摘 要 以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针，对橡胶树转录组数据库进行搜索，并设计引物进行PCR扩增，得到7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列，命名为HbCaM1-7。序列分析结果发现，HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp，编码149个氨基酸，分子量为16.8 ku，等电点为3.95。其中，HbCaM1-6间氨基酸同源性为100%，HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面，HbCaM1-7均为一个内含子，且内含子的插入位置相同，但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出，钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面，HbCaM1-6在各组织中均有表达，除了HbCaM3在根中表达丰度相对较高，其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高，而HbCaM7在各组织中的表达均比较低；乙烯利处理后，HbCaM2-7的表达均有一定的上升趋势，而在叶片发育过程中HbCaM1-5?V呈明显下调表达。由此可见，橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。 　　关键词 巴西橡胶树 ；钙调蛋白 ；基因克隆 ；基因家族 ；表达分析 　　中图分类号 S794.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.009 　　在植物生长发育的过程中，钙离子作为第二信使扮演着至关重要的角色。钙调蛋白（Calmodulin，CaM）是一类存在于动植物真核细胞内和钙离子相结合的小分子蛋白[1]，也是生物细胞内功能和分布最广泛的高度保守的蛋白之一[2]。钙调蛋白有4个Ca+结合域，多数CaM氨基酸序列的长度为148个，细胞内钙离子浓度升高，使钙调蛋白的钙离子结合位点被占据，因而改变了其构象，并促进其与细胞内靶酶的结合，由此改变细胞内的代谢活动。由于钙调蛋白重要的调控功能引起了人们的重视，钙调蛋白基因在动物[3-4]、真菌[5]和原生动物[6]中都已被分离和克隆。在植物界，迄今为止已成功克隆了拟南芥[7]、水稻[8]、大麦[9]、苜蓿[10]、香蕉[11]等物种的钙调蛋白基因，并对其进化和表达进行了分析。在橡胶树中，仅有陈鑫等[12]利用RACE克隆了一个钙调蛋白基因HbCAM1，并利用RT-PCR技术对该基因在不同组织和乙烯利处理胶乳中的表达进行了初步分析。随着橡胶树基因组测序的完成，使人们能够对整个橡胶树钙调蛋白基因家族进行全面系统的分析。本研究从橡胶树转录组和基因组数据库中搜索并克隆得到7个钙调蛋白基因，并从基因结构、系统进化和表达模式几方面对这些家族成员进行了全面系统的分析。研究结果将有助于深入了解钙调蛋白基因家族成员在橡胶树生长发育和胁迫应答调控方面的重要功能。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 　　本实验室Solexa测序所用的材料是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研7-33-97，其中胶乳、树皮、树叶、种子、雌花和雄花均来自中国热带农业科学院试验场三队的正常割胶橡胶树（开割2 a以上），根来自于中国热带农业科学院橡胶研究所种质资源圃华于伟老师赠送的热研7-33-9 组培苗；不同发育时期的橡胶树叶片来自于中国热带农业科学院橡胶所种质资源圃，为一年生的热研7-33-97嫁接苗；乙烯利处理的材料来自于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场三队，品系为热研7-33-97，正常开割树（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同时间处理橡胶树，相应4个时间点处理为0、3、12和24 h。 　　1.1.2 菌株与试剂 　　反转录试剂盒购自Fementas公司；pMD18-T载体和Taq DNA聚合酶均购自Takara公司；引物合成和测序由华大生物技术有限公司完成；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；其它生化试剂和常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 不同组织RNA的提取与cDNA合成 　　橡胶树胶乳RNA的提取参照Tang等[13]的方法；除胶乳以外其他组织的RNA提取方法参照Kiefer等[14]的方法；cDNA第一条链的合成采用反转录试剂盒，操作步骤按照Fementas公司产品说明书进行。 　　1.2.2 cDNA全长和基因组序列的克隆 　　利用拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列，通过本地BLAST搜索本实验室EST数据库，得到7个钙调蛋白基因的cDNA片段。然后设计特异性引物进行PCR扩增（表1），具体反应体系如下：模板（胶乳cDNA）0.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、Taq plus DNA Polymerase（5 U/L） 0.3 μL、dNTPs（2.5