基因工程药物指南.ppt

八、目的基因在受体细胞中的表达 基因表达：结构基因在生物体内的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因的高效表达：外源基因在生物体内的转录、翻译以及所有加工过程 真核基因在原核细胞中表达的困难 细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子 mRNA的SD序列不能与核糖体结合 真核蛋白易被细菌蛋白酶破坏 几种常见的表达系统 原核表达系统 （一） 原核细胞表达体系 大肠杆菌：最常用的表达形式。 1、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的剂量 外源基因的表达效率 启动子的强弱：容易被RNA聚合酶识别并能够稳定结合； 核糖体结合位点的有效性；消除相关二级结构。 SD序列和起始密码的间距； 密码子组成；选择大肠杆菌偏爱的密码子。 表达产物的稳定性 组建融合基因； 利用内源或外源信号肽将产物运送到胞间浆周质； 改变真核蛋白质二级结构； 采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌。Ion-营养缺陷型大肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。 D 细胞的代谢负荷 外源基因的表达产物可能本身对宿主菌有毒性，或因消耗其氨基酸等营养物质对宿主菌产生间接毒害。 解决方案： 将细胞的生长和外源基因的表达分为两个阶段； 将细胞的生长与质粒的表达分开； 蛋白质以包涵体形式存在。 E 工程菌的培养条件 pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60在42℃时，拷贝数迅速增至300 – 600。 2 真核基因在大肠杆菌中的表达形式 ① 以融合蛋白的形式表达药物基因 蛋白质在菌体内比较稳定； 融合蛋白本身不能做注射用药； 可以通过特殊设计，将两类蛋白分开。 凝血因子Xa专一识别 Ile-Glu-Gly-Arg; CNBr专一性切割甲硫氨酸。 ② 以非融合蛋白的形式表达药物基因 外源基因的表达产物不含细菌多肽序列。 易被细菌蛋白酶降解； 常含有甲硫氨酸，用药时易引起免疫反应。 外源基因的结构 ③以分泌型表达蛋白药物的基因 外源基因的表达产物在胞质内合成，后被运输至细胞周质，信号肽被信号肽酶识别、切割。 避免被细菌蛋白酶降解； 产物不含有甲硫氨酸； 产量不高； 信号肽不切割或切割位置不正确。 外源基因的结构 3 枯草芽孢杆菌 优势：分泌能力强，将蛋白质产物分泌到细胞液中，故不产生包涵体； 局限性： 具有极强的胞外蛋白酶，对产物进行不同程度的降解； 能进行产物的糖基化。 （二） 真核细胞表达体系 酵母：最有效的单细胞真核微生物。 常用啤酒酵母。 动物（哺乳动物和昆虫） 植物细胞 1 载体的分类：根据载体的复制序列分为四类： （1）YEp类：复制序列为酵母天然的2m-双链环状质粒成分。拷贝数可高达100-200。 （2）YRp类：非2m-来源的自主复制序列（ARS）。拷贝数5-10。 （3）YCp类：非2m-来源的自主复制序列（ARS）。含酵母染色体中心粒成分，拷贝数1。（4）YIp类：含有可与酵母染色体重组的序列，整合到酵母染色体中，随酵母染色体一起复制，稳定性好。拷贝数1 。 2 克隆载体 质粒转化酵母通常有两种方式： 碱金属离子（Li)介导的酵母菌完整细胞的转化 酵母菌电击转化法 鉴于从大肠杆菌转化和制备质粒比酵母容易的多，可向酵母载体中引入大肠杆菌的起始和抗生素筛选标记，此类克隆载体即可以在细菌中，又可以在酵母中进行质粒复制和表型选择。 3 表达载体 影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1 外源基因的剂量：高拷贝数质粒常会引起细胞生长量降低。 2 外源基因的表达效率： （1）启动子： 组成型启动子：在各个生长时期表达 诱导型启动子：受诱导物或诱导条件的影响 酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开; PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子，PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活，因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭，23℃诱导表达. （2）分泌信号的效率： （3）终止序列的影响： 终止序列保证了转录产物（mRNA）在适当部位终止，并加上polyA尾巴。 常用的终止子有：ADH1, CYC1, MF∝1，PGK。 3 外源蛋白的糖基化 外源蛋白在酵母细胞中存在两种糖基化形式：N-糖苷键（天冬酰胺连接）和O-糖苷键（丝氨酸或苏氨酸连接），与天然状态下相同。 酵母细胞能够识别这两种糖基化信号，使外源蛋白正确折叠，产生与天然状态相同的蛋白，分泌到胞外。 第三节 基因工程菌的不稳定性 一、质粒的不稳定性 1 质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定 2 质粒的不稳定性产生的原因 （1）工程菌的质粒由于分裂的原因而不稳定； 工程菌分裂时会产生不含质粒的子代菌，造成质粒的丢失