[医学]质粒DNA提取鉴定.pptVIP

质粒DNA的提取、定量酶切鉴定 /sfzx/ 实验内容 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作 第二部分 质粒DNA提取与定量 Extraction and Quantitation of Plasmid DNA 独立于细菌染色替外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子； 存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多． 碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 质粒DNA释放法 酸酚法等 分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒DNA 2、离心层析柱 溶液 P1 溶液 P2 溶液 P3 去蛋白液 PE 漂洗液 WB 洗脱液 EB 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块 0.2 mol/ L NaOH 1% SDS 作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次 5mol/L 乙酸钾 60 ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，Na＋可中和DNA 注意：复性时间不宜过长 紫外光吸收法 计算方法: 因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。 记录A260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下: 质粒DNA(?g /ml)=50×(A260) × 稀释倍数 根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280） 实验仪器 第三部分 酶切鉴定 DNA Restriction Enzyme Digestion 限制性内切酶（restriction endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。 特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。 Buffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表 酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。 以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外该酶可分解15μg的DNA。 第四部分 琼脂糖凝胶电泳 DNA Agarose Gel Electrophoresis 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性. Gelview: 是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高, 且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光. 思考题 碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？ 结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 影响PCR的主要因素有那些? 5’ G-A-A-T-T-C 3’ 3’ C-T-T-A-A-G 5’ G C-T-T-A-A 5’ 5’ A-A-T-T-C G EcoRI ★5’端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。 5’ A-A-G-C-T-T 3’ 3’ T-T-C-G-A-A 5’ A T-T-C-G-A 5’ 5’ A-G-C-T-T A HindIII 限制性内切酶 双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER 如果