实验五 dna的限制性内切酶酶切反应(定稿)【最新】.docVIP

实验五 DNA的限制性内切酶酶切反应 DNA restriction enzyme digestion 一、实验目的 通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。 二、实验原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5- G↓AATTC-3),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5-CCC↓GGG-3);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5…G↓AATTC…3 →5…G AATTC…3 ；3…CTTAA↑G …5 →3…CTTAA G…5 。Pvu I 的识别序列5…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3 →5…ＣＧＡＴ　 ＣＧ…3 三、实验仪器与设备 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统 四、实验材料与试剂 pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp) 10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X） 琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭： 5×TBE 电泳缓冲液： （使用时稀释10倍） 6×电泳载样缓冲液： 五、实验步骤 1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg） 和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。 2. 混匀反应体系后,将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2--2.5 小时,使酶切反应完全。 3.每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。(可以不加) 4.制备琼脂糖凝胶分析内切酶酶切反应结果 配制1.0%琼脂糖凝胶，加入适当的EB溶液，制胶。取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀电泳。100V20min，60V，40min。电泳结束后，紫外灯下观察结果。根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图， 六、注意事项 　　1、DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分 HYPERLINK /view/48578.htm \t _blank 限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 2、当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。 3如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。 若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。 　　若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 4. 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA 用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加1 单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多, （DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直