赤点石斑鱼神经坏死病毒现场快速核酸检测 方法的建立与应用-establishment and application of rapid nucleic acid detection method for neural necrosis virus of epinephelus akaara.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 赤点石斑鱼神经坏死病毒现场快速核酸检测方法 的建立与应用 The Establishment and Application of On-site and Rapid Detection Methods for Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus 学位论文完成时间： 指导教师签字： 答辩委员会签字： ii 赤点石斑鱼神经坏死病毒 现场快速核酸检测方法的建立与应用 摘 要 神经坏死病毒（nervous necrosis virus, NNV)是多种海水养殖鱼类的病原，容 易感染稚鱼和幼鱼。其导致的病毒性神经坏死病死亡率高，给养殖业带来了巨大 的经济损失。对该病的治疗还没有有效的药物和疫苗，因此开发简便、灵敏度高、 特异性强的快速检测 NNV 的方法非常重要。 本文针对赤点石斑鱼神经坏死病毒，设计了特异性引物，建立了交叉引物等 温扩增体系，并对该方法的 Mg2+浓度、dNTPs 浓度、反应温度三个重要参数进行 了优化。优化后的反应体系为：5 mmol/L MgCl2、1.2 mol/L Betaine、1.2 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L 引物 1a、0.8 μmol/L 引物 2a/3a、0.2 μmol/L 引物 4s/5a、10 × ThermoPol Buffer 2.5 μL、Warmstart Bst DNA 聚合酶 8 U、M-MLV 反转录酶 28 U 以及适量的 RNA 模板，DEPC 水补足至 25 μL。优化后的反应参数为 69 oC 保温 60 min，然后 80 oC 保温 5 min 终止反应，最后采用切向流试纸条通过肉眼判断检 测结果。该方法的检测极限为 101copies/μL RNA 模板 ,比常规 RT-PCR 高 10 倍， 与荧光定量 RT-PCR 灵敏度相当。该方法反应特异性良好，与病毒性出血性败血症 病毒（VHSV）、传染性胰脏坏死病毒（IPNV）、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、 淋巴囊肿病毒（LCDV）、哈维氏弧菌(Vibrio. harveyi)、鳗弧菌(V. anguillarum)等多 种鱼类病原均无交叉反应。使用该方法对实际样品进行检测，与 LAMP 试剂盒方 法相比较，更容易分辨阴性和弱阳性。本实验所建立的赤点石斑鱼神经坏死病毒 交叉引物等温扩增联合切向流试纸条方法（CPA-LFD）简单、快速、灵敏度高且 特异性强, 可以广泛用于疾病的现场快速诊断。 近年来，表面增强拉曼光谱（SERS）用于基因的检测越来越受到研究者们的 关注。本研究还为快速检测鱼类神经坏死病毒，设计了病毒特异性的发夹型探针， iii 经硫醇修饰后与纳米银溶胶结合，制备了鱼类神经坏死病毒纳米探针（Ag-NNV）， 并使用透射电镜、多功能酶标仪、表面增强拉曼光谱仪等对纳米探针 Ag-NNV 的 表征及发夹型探针在纳米银粒子表面的覆盖率进行了测定和分析。结果表明，裸 露的纳米银粒子为球形，平均直径 50 nm；制备的纳米探针颗粒为球形，平均直径 90 nm。纳米银粒子和纳米探针在溶液中均具有良好的分散性。平均每个纳米银粒 子表面结合发夹型探针约 100 条，单位表面积的探针覆盖量为 0.56 pmol/cm2。该 纳米探针制备简便，适合用于表面增强拉曼散射法对鱼类神经坏死病毒进行快速 检测。 关键词：赤点石斑鱼神经坏死病毒，交叉引物，切向流试纸条，纳米探针，检测 iv The Establishment and Application of On-site and Rapid Detection Methods for Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus ABSTRACT Nervous necrosis virus ( NNV) is a major pathogen of viral nervous necrosis disease in a variety of marine aquaculture animals. It was susceptible to juvenile fish and larva fish and with high mortality after infection. The disease brought huge economic losses to aquaculture. However, there were no effective drugs and vaccines for the disease, so the development of a simple, high