高产酒率酿酒酵母单倍体分离跟杂交育种.ppt

许燕晴 摘要 本文在筛选获得一批酒精发酵力较强的二倍体酿酒酵母菌株的基础上，优化产孢条件，应用筛选获得的高产酒精的单倍体菌株，经杂交育种构建高产酿酒酵母菌株。以二倍体菌株ZJD3一3、ZJD3一4、ZJD3一7、ZJD3一9和ZJD3一11(称为ZJD3系列)及非整倍体菌株c19为实验菌株，经对产孢培养基的优选，确认McClary产孢培养基为适宜的高产孢率培养基。在该培养基上经25℃、7天培养，酿酒酵母的产孢率可达到47%。对ZJD3系列二倍体菌株进行单倍体分离，获得单倍体71株。对筛选所得单倍体菌株，以及实验室原有单倍体菌株c36、c36一8、c36一9进行交配型和发酵性能测定，交配型为a型的单倍体与交配型为α的单倍体数目差异较大。得交配型a的单倍体菌株30株，交配型α的单倍体菌株18株。从中筛选获得发酵性能较强的单倍体菌株4株，其中1株为a型，3株为α型，发酵性能最强的zs-5菌株其同等条件下酒精发酵后的酒度高出二倍体亲株4.5%。 以得到的4株强发酵菌株和单倍体菌株c36、c36一8、c36一9以及非整倍体菌株 C19为杂交亲株，分别进行群体杂交，发现不同交配型单倍体混合2h后开始出现哑铃型细胞，平板分离培养48h后，经鉴定共获得杂合子124株，经酒精发酵测验，从中筛选获得发酵性能优良的酵母菌株6株。结果表明，95%以上的杂合子酒精发酵性能优于杂交亲株，最优者比杂交单倍体亲株提高 17.7%，比原始二倍体菌株高15.5%。经杂交育种与重复酒精发酵测验，最终确认zj一1、zj一2、zj一3、zj一、zj一5、zj一6等6株高产酒精的菌株，为进一步选育构建超级工程菌株奠定了扎实基础。 前言 酒精生产用酿酒酵母属于子囊菌亚门中的酵母菌科成员，主要以出芽方式进行繁殖，属单细胞真核微生物。利用酿酒酵母发酵糖类生产乙醇的历史非常悠久，目前世界乙醇产量的80%以上是通过酿酒酵母以淀粉质或其他糖质原料发酵生产的. 酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精，其生化途径主要由两个阶段组成。第一个阶段为己糖通过糖酵解途径(EMP途径)分解生成丙酮酸。第二个途径丙酮酸由脱羧酶催化形成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原生成乙醇。葡萄糖发酵生成乙醇的总反应简式为: C6H206→2C2H50H+2C02+能量 就理论而言，酿酒酵母行酒精发酵，每消耗 1mol葡萄糖可产生 2mol乙醇，即180克葡萄糖产生92克乙醇，理论得率为51.n%。可在生产实际中，远未达到此得率。原因是酵母发酵过程中除主要生成乙醇外，还生成少量的其他副产物，包括甘油、有机酸(乙酸、乳酸、墟拍酸等)、杂醇油(高级醇)、醛类等，大约有4一10%的碳源将被用于形成副物，加之工艺条件与其他环境因素的影响，实际可发酵性糖的利用率更低。我国目前工业规模的酒精生产因不同地区、企业、所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异，糖醇转化率一般在85一90%之间。 自改革开放以来，由于我国经济与社会的持续快速发展，能源需求快速增长与供给能力严重不足的矛盾日益突出，环境空气污染的日益加剧，己经成为制约社会可持续健康发展的瓶颈之一。2000年后，国家开始具体实施发展可再生、替代性、环保型能源战略，先后在我国黑龙江、吉林、河南、安徽四省布局建设以农作物所含有淀粉或糖质原料生产可再生、环保型、替代性能源—---燃料乙醇的定点生产基地，2006年生产规模已达到100余万吨，并以较快速度发展至本五年计划末达到近500万吨/年的生产规模。 由于燃料乙醇的大规模生产消耗了数量比较巨大的淀粉与糖质原料，导致相应原料的市场价格较快速上扬，燃料乙醇生产成本不断上升，虽然现燃料乙醇定点生产得到国家一定的财政补贴，但目前原料价格上涨幅度已使燃料乙醇生产企业濒临亏损边缘。因此，构建酒精高产酵母，对于降低燃料乙醇生产成本，确保燃料乙醇生产企业利润，促进其自身稳定发展，顺利实现国家新能源战略目标，保持社会与经济可持续健康发展等均具重要的意义。 长期以来，提高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产酿酒酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离筛选。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性，需要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良，使其达到工业大生产的要求。诱变育种是菌种选育的重要方法之一，通过各种物理和化学因子诱变，能够得到性能增强的酵母菌株。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟，采用原生质体融合和重组DNA技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建，其研究报道屡见不鲜。通过代谢工程手段阻断酿酒酵