中药复方研究探究 室细胞跟分子实验操作指南.doc

PAGE PAGE 32 中药复方研究室细胞与分子实验操作指南 （2009.9） 目 录 TOC \o 1-2 \u 第一章 细胞实验操作 PAGEREF _Toc179380421 \h 3 第一节 细胞培养常用耗材与设备 PAGEREF _Toc179380422 \h 3 第二节 无菌操作 PAGEREF _Toc179380423 \h 3 第三节 培养用品的清洗 PAGEREF _Toc179380424 \h 5 第四节 培养用品的消毒灭菌及灭菌锅的使用 PAGEREF _Toc179380425 \h 6 第五节 常用缓冲液、胰蛋白酶消化液及培养基的配制 PAGEREF _Toc179380426 \h 8 第六节 细胞培养、换液、消化传代 PAGEREF _Toc179380427 \h 11 第七节 细胞计数 PAGEREF _Toc179380428 \h 14 第八节 细胞复苏与冻存 PAGEREF _Toc179380429 \h 16 第九节 MTT法测定细胞活力或细胞增殖 PAGEREF _Toc179380430 \h 17 第二章 分子实验操作 PAGEREF _Toc179380431 \h 18 第一节 PCR引物设计与实验操作 PAGEREF _Toc179380432 \h 18 第二节 Western blot 实验操作 PAGEREF _Toc179380433 \h 26 第三节 Flow cytometry实验操作 PAGEREF _Toc179380434 \h 32 第一章 细胞实验操作 细胞培养常用耗材与设备 准备室中常见耗材与设备 去离子水制备器、酸缸、烘箱、高压灭菌锅、储备柜（放置干净未消毒的物品）。 容量瓶（500 ml，1L）、锥形瓶（500 ml，1L）、磁力搅拌器、pH计、电子精密天平、台式离心机、冷冻离心机、涡旋器、普通冰箱（4℃，-20℃）、超低温冰箱（-70 细胞培养瓶（25mm2，75mm2 ，175mm2）、细胞培养板（96-well，24-well，12-well，6-well）、细胞培养皿（35mm，60mm）、细胞冻存管（2ml，5ml）、离心管（10ml）、移液管（2ml，5ml，10ml）。 移液枪（2.5μl，10μl，100μl，200μl，1000μl，5ml），枪头（10μl，200μl，1ml；颜色分别为：白，黄，蓝），eppendorf管（0.5ml、1.5ml）。 细胞房中常见耗材与设备 超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、普通冰箱（4℃，-20℃ 酒精喷壶（装75%酒精），酒精棉（浓度为75%）、纯酒精（95%，酒精灯使用） 无菌操作 无菌室的打扫与灭菌 定期打扫无菌室：先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰新洁尔灭擦拭。 培养箱定期灭菌：用75%酒精擦拭孵箱内部（最好同时将孵箱中各隔层拆下），再用紫外灯照射。（对于含有自动灭菌程序的孵箱，先用75%酒精擦拭后，再启动其灭菌程序） 实验前细胞房与超净台的灭菌：打开紫外灯，照射30min左右。 每天实验结束后，应及时清理垃圾筒中垃圾。 实验人员的无菌准备 实验前应用肥皂洗手。 穿好实验服，更换拖鞋。 75%酒精消毒双手。 操作台中的无菌操作 在超净台经紫外照射灭菌后，实验人员应注意在通风条件下进行实验操作。 在通风条件下，先点燃酒精灯，再用酒精棉擦拭超净台桌面（尽可能的大于自己所用台面），同时保持工作区域的宽敞。 实验人员应清除无菌区与有菌区的概念。超净台虽经紫外照射除菌，但也是相对的，因此，操作时应靠近酒精灯火焰。 操作时应尽量减少手臂的运动，尽可能避免左右手交叉（近手操作）：把需要有用的工具和试剂尽可能放在手边，以酒精灯为界，左手用的东西放在酒精灯的左边，右手用的东西放在右边。例如，一个右手操作者要从试剂瓶里吸取液体，则移液枪应放在右手，而枪头与试剂瓶都应放在左手边。 带入操作台中的物品，应注意：刚经高压灭菌的可以直接放入超净台中；临时带进来的，应先用75%酒精擦拭或喷洒后再放入超净台，这类物品包括各种装培养基、缓冲盐等的瓶子、试管架、胶塞等。 要养成用镊子操作的习惯：拿取饭盒中的各类物品，尽可能用镊子去夹取；对于小的物品，如瓶盖、枪头、eppendorf管，应避免用手直接去拿取。 打开的瓶子，应放在酒精灯火焰旁，瓶盖反放朝上。禁止在打开试剂瓶包括瓶盖的正上方进行实验操作（包括跨越敞开的开试剂瓶上方去拿取东西）。 实验结束后，依次将个人物品带出超净台（包括废液缸），用酒精棉擦拭桌面，熄灭酒精灯，最后调小风力并关掉日光灯。 废液的处理：先将废液缸中的液体倒入下水道，再将废