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昆虫血淋巴收集技术与方法 　　摘要　血淋巴是昆虫生理生化研究的重要材料之一。文章分析归纳各类昆虫血淋巴的不同收集方法、收集前的昆虫准备以及收集后血淋巴的预处理，并结合该试验室研究阐述在收集昆虫血淋巴过程中的一些问题和经验，为能有效提取血淋巴提供一定的方法支持。 　　关键词　昆虫，血淋巴，收集方法 　　 　　昆虫血淋巴是血液和淋巴液的混合物，在昆虫的开放式循环系统中循环，是昆虫代谢的重要场所，也是代谢过程中各种物质储存和交换的场所。在昆虫的防御、抗冻、免疫、损伤应答等方面起重要作用。目前，血淋巴已成为昆虫研究中最常用的研究材料之一。由于昆虫大多个体较小，血淋巴含量少，离体后容易发生凝血和黑化反应，给收集工作带来一定难度。郭郛和忻介六以及陈长琨虽有所介绍，但迄今为止国内尚少关于昆虫血淋巴收集方法的专门报道。作者结合该试验室收集荒漠昆虫血淋巴时的经验，对昆虫血淋巴的收集方法作一概述。 　　 　　1　收集血淋巴前的昆虫准备 　　 　　在收集血淋巴之前，一般需要对昆虫进行清洗、体表消毒、麻醉等过程。因试验目的和要求不同而选择不同类型的清洗液、消毒方式和麻醉方式。 　　清洗昆虫时，一般选用蒸馏水、去离子水或PBS，清洗后用滤纸吸干。常采用70％或75％(v/v)的酒精进行体表消毒。 　　麻醉可分为乙醚麻醉、C02麻醉、浸水麻醉、冷冻麻醉等。 　　浸水麻醉通过将昆虫在水中浸没一定时间使之麻醉。冷冻麻醉是将昆虫骤然置于低温环境下处理一段时间，致其活动能力暂时丧失，从而达到麻醉的效果。常用的方法是在4－5℃处理10－15 min或在冰面上冷冻5－30 min；此外，还有零下低温短时间处理昆虫的报道。 　　 　　2　收集昆虫血淋巴的方法 　　 　　近年来，随着昆虫血淋巴研究的深入以及所研究昆虫种类的增多，收集昆虫血淋巴的方法也呈多样性，主要有蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨或匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等。详述如下。 　　 　　2.1蜡盘法 　　这是一种新的提取血淋巴的方法。具体操作是先将融化后的蜡滴到一张石蜡封口膜(Data film)上(蜡层厚度视昆虫大小而定)，将封口膜置于50－60℃的电热板上再次将蜡融化，之后依据抽取血淋巴的部位朝上放入昆虫，当蜡完全浸没昆虫时，将封口膜移开电热板，待蜡凝固变硬。在双筒显微镜下，用针将被包埋的昆虫的1条后腿或翅移除。用10μL的移液器吸取少许无RNase水，冲洗伤口3－4次。然后，用巴斯德吸液管收集稀释后的血淋巴。 　　蜡盘法的优点是：将昆虫固定于蜡中，有利于血淋巴的收集，可有效避免消化道内容物等对血淋巴的污染；缺点是：电热板的温度(50－60℃)会对血淋巴有一定的影响，实际收集到的血淋巴为稀释后的血淋巴，量较少，收集后致昆虫死亡。该方法主要应用于蚜亚目Aphidomorpha、双翅目Diptera部分昆虫。 　　 　　2.2离心法 　　采用离心法收集血淋巴时，一般先使昆虫形成开放性伤口，在离心管的下段加上玻璃棉过滤器，再将昆虫伤口朝下置于离心管中；也可直接将昆虫置于离心管中，在一定的转速下离心一段时间后，从离心管底部收集血淋巴。 　　Xu等采用双管离心法。操作方法是：在0.5 mL的锥形离心管底部用针扎数个小孔，放入破开了腹壁的昆虫，将其插入到1.5 mL微量离心管中，离心后从1.5 mL离心管底收集血淋巴。 　　离心法收集的血淋巴量较稳定(尤其以双管离心法为显著)，可用于大规模收集。双管离心法设计巧妙，可有效地收集蚊等小型昆虫的血淋巴，但在实际的操作中要根据不同的昆虫摸索合适的离心力，不然或者使收集到的血淋巴过少或者易使血淋巴被消化道内容物等污染。该方法主要应用于鞘翅目Coleoptera、双翅目Diptera等昆虫。 　　 　　2.3背血管取血法 　　使用该方法收集昆虫的血淋巴时，可将1支玻璃微量吸管或5μL的哈密顿微量注射器直接插进昆虫背血管，收集血淋巴。也可先用无菌的昆虫针刺破昆虫的动脉或心脏，再用微毛细管收集流出的血淋巴。 　　该方法操作简便，可借助毛吸力和昆虫心脏搏动的双重作用来收集血淋巴，取血速度快，收集到的血淋巴量相对较多，短时间内昆虫仍具有活动性。主要用于膜翅目Hymenoptera、鳞翅目Lepidoptera和蚤目Siphonaptera等昆虫。 　　 　　2.4灌注法 　　灌注法是用微量注射器将一定体积的抗凝血剂或生理盐水等注射进昆虫的血腔，再通过移除昆虫的后足或撕开昆虫腹部的来收集血淋巴。 　　该方法是较为经典的方法，可以有效解决小型昆虫血淋巴量少不易收集的难题，便于昆虫血细胞的观察研究，但操作时要注意避免将灌注液注射进消化道。该方法适用于蚜亚目Aphidomorpha、双翅目Di