广西地方标准柑橘衰退病毒RT-PCR检测技术规程（征求意见稿）.docVIP

DB45/T ××××—2013 DB45/T ××××—2013 PAGE 4 PAGE I DB45广西壮族自治区质量技术监督局 发布2013-XX-XX实施2013-XX-XX发布柑橘衰退病毒RT-PCR检测技术规程Rule of Detection Method of RT-PCR for Citrus Tristeza Virus DB45 广西壮族自治区质量技术监督局 发布 2013-XX-XX实施 2013-XX-XX发布 柑橘衰退病毒RT-PCR检测技术规程 Rule of Detection Method of RT-PCR for Citrus Tristeza Virus （征求意见稿） DB45/T XXX—2013 广西壮族自治区地方标准 ICS B16 备案号 I 目 次 TOC \f \h \t 前言、引言标题,附录标识,参考文献、索引标题,章标题,附录章标题 HYPERLINK \l _Toc322902285 前 言 II HYPERLINK \l _Toc322902286 1 范围 PAGEREF _Toc322902286 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902287 2 缩略语和定义 PAGEREF _Toc322902287 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902288 3 原理 PAGEREF _Toc322902288 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902289 4 样品采集 PAGEREF _Toc322902289 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902290 5 柑橘衰退病毒分子鉴定(RT-PCR) PAGEREF _Toc322902290 \h 2 HYPERLINK \l _Toc322902291 6 结果判定 PAGEREF _Toc322902291 \h 4 HYPERLINK \l _Toc322902292 7 检测后样品的处理 PAGEREF _Toc322902292 \h 4 HYPERLINK \l _Toc322902293 附　录　A （资料性附录） 柑橘衰退病症状特征 PAGEREF _Toc322902293 \h 5 HYPERLINK \l _Toc322902294 附　录　B （规范性附录） 试剂和溶液配制 PAGEREF _Toc322902294 \h 6 II 前 言 本标准的附录A是资料性附录，附录B是规范性附录。 本标准由广西壮族自治区农业厅提出并归口。 本标准由广西壮族自治区柑桔研究所起草。 本标准主要起草人：邓崇岭，娄兵海，赵小龙，陈国平，王明召，陈传武，唐艳，王作义，邓光宙王存婷，付慧敏。 本标准为首次发布。 PAGE 3 柑橘衰退病毒RT-PCR检测技术规程 范围 本标准规定了柑橘衰退病毒实验室分子检验技术要求。 本标准适用于对芸香科植物感染柑橘衰退病毒的检验、检测和鉴定。 缩略语和定义 下列缩略语和定义适用于本标准。 缩略语 bp： 碱基对 RNA ：核糖核酸 cDNA：互补脱氧核糖核酸 DNA：脱氧核糖核酸 DEPC：焦碳酸二乙酯 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 Taq酶：Taq DNA聚合酶 EB：溴化乙锭 Tris：三羟甲基氨基甲烷 EDTA：乙二胺四乙酸 SDS：十二烷基硫酸钠 柑橘衰退病 由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus, CTV）引起、主要通过嫁接传播及桔蚜(Toxoptera citricidus)、桔二叉蚜（T. aurantii）、棉蚜(Aphis gossypii)和绣线菊蚜（A. citricola）传播的一种危害柑橘属和一些柑橘属近缘植物的重要病害。 原理 根据柑橘衰退病毒基因组序列设计一对特异性引物，先通过反向引物与衰退病毒RNA结合，在反转录酶的作用下，合成cDNA第一链，然后在正反向引物及热稳定DNA聚合酶的作用下，合成大量目标DNA片段，最终通过凝胶电泳分离检测出特定大小的柑橘衰退病毒特异性DNA谱带，根据该谱带的有无确定样品是否带有柑橘衰退病毒。 样品采集 鉴定取样 采有典型和疑似症状（参见附录A）的植株叶片，树苗每株采5张叶片，大树每株采20张叶片，样品保湿后装入可密封塑料袋中，5 d内送实验室检验。 4.2 监测取样 采取Z字型五点取样法，每个点选取3株，每株分东南西北四个方位采集叶片，树苗每方向采1张叶片，大树每方向采5张叶片，样品保湿后装入可密封塑料袋中，5 d内送实验室检验。 柑橘衰退病毒分子鉴定(RT-PCR) 试剂 除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用DEPC处