凝胶层析恒压加液装置（五）.ppt

* * 四、凝胶层析技术 （一）凝胶的选择与处理 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。—般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论 。 1．类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好 的分离效果。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。 2．分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入， 第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见下图）。 不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图 凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。 葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。 （二）装柱 一般选用细长的拄作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。 一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。 层析柱 ?（a）自制简易层祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子） 层析系统连接示意图 1．密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶； 4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪 BS－100自动部分收集器安装圈 1．反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14