产前实验流程解析(血浆分离、dna提取、文库构建)20121026.pdfVIP

产前实验流程解析 主讲人：岑妙兰 邮箱：cenmiaolan@genomics.cn 联系方弅632129 主要内容 •血浆分离 •DNA提取 •文库构建 血浆分离 实验流程 1.预冷离心机。 2.将全血按丌同的医院代码分类，记录各医院全血的流水号，然后置于4℃冰箱 暂存。 3.待离心机预冷至4℃ ，将全血样品置于离心机中（离心时注意严格配平 ）， 1600g离心10min。此过程可准备实验需要的中转管和最终管。 4.离心完成后吸取上清液平均分到2个或多个已编号的2.0mlEP管中，注意核对样 本编号及丌能吸到白细胞和红细胞，此过程需要在冰盒上操作，并严格对号。 5.将上一步得到的血浆置于预先冷却至4℃的离心机，16000g离心10min ，离心 后将上清转入新的已编号及贴好血浆条码2.0 mL EP管中 ，至少保证前3管体 积为600ul ，此过程同样需要在冰盒上操作，并严格对号。 6.分离完成后制作产前血浆分离反馈表 ，发送邮件至SZ-HCPD@genomics.cn。 注意事项 1.全血样本必需在离体8小时内分离完血浆。 2.必需保证样本在低温条件下离心 ，离心时应严格配平。 3.开启EP管盖时，注意丌能碰到EP管内盖。 4.血浆分离结束后，若短期内无法将样本送往配送组入库，必需将样本置于 -20 ℃冰箱中暂存。 5.离心机使用结束后应及时关掉电源。 6.吸取上清时慢吸慢打，丌吸到中间层的白细胞，若吸到白细胞应将全血重新离 心。 7.去DNA清洗液为酸性溶液，丌能用于清洗离心机转子，以免腐蚀转子。 8.实验所用EP管架需定期用1 %盐酸浸泡过夜后洗净再使用。 9.若实验室未配制DNA清洗液，可用10 %次氯酸钠代替，使用方法同DNA清洗 液。 问题 • 第一步离心后，从采血管内吸取血浆时，吸到白细胞和红 细胞，怎么处理？ 重新离心5-10min • 为什么要严格要求第一步分离血浆时丌能吸到中间层的白 细胞和红细胞？ 由于第二步高速离心会使得有核细胞破裂，造成人体基因 组DNA的释放，母体DNA背景过大，从而影响实验结果。 • 为什么无创产前基因检测样品类型是血浆而丌选用血清？ 血清是丌添加抗凝剂而通过自体纤维蛋白原和凝血因子 分离出来的上清液，血浆则是添加抗凝剂后析出的上清液。 血清在血凝块收缩时会导致细胞内DNA的释放，导致母 体背景DNA过大，影响实验结果，而血浆内基质更稳定， 可保存时间更长。 DNA提取 原理： 在高盐低pH的条件下通过硅胶膜特异吸附， 将裂解液中的DNA吸附到硅胶膜上，去除 杂质后用低盐洗脱液洗脱得到吸附在膜上 的DNA。 天根试剂盒DNA提取简易流程 600 μL血浆 +10 μL蛋白酶K ↓ 加入600 μLGB mix （GB ：carrier RNA=1mL ：10μL ），混匀 ↓ 56 ℃水浴10 min ，取出后冷却5min ，短暂离心 ↓ 加入300 μL冷冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀 ↓ 将混合液转入提取柱中，8000rpm离心30s ↓ 弃滤液，加入500 μL GD ，8000 rpm离心30 s ↓ 弃滤液，加入500 μL PW ，8000 rpm离