基因表达跟蛋白质纯化技术探讨.ppt

基因表达与蛋白质纯化技术探讨 复旦大学生物化学系 黄伟达 whuang@fudan.edu.cn 2004年5月18日 内 容 基因表达体系及优劣势 大肠杆菌中表达蛋白质 可能碰到的问题 基因工程的应用领域 1.? 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3.? 疾病的基因治疗 4.? 食品、化工用酶制剂 5.? 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集 基因表达体系 1.? 原核体系 2. 真核体系 大肠杆菌 (Escherichia coli) 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰 枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体 其 他 乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 真核细胞表达体系 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞/组织 植物细胞/组织 酵母细胞 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达; 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高; 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe） 昆虫细胞 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白; 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限； 作为药物宿主细胞未被FDA认可 CHO细胞 可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高 植物组织 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制； 表达量较难提高，分离纯化不方便 动物乳腺组织 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产； 转基因动物制作花费巨大，实验周期长 鸟类输卵管组织 分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便； 实验成本低，饲养费用低； 加糖方式可能与人有所不同 体系选择 研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素? 在大肠杆菌中生产人凝血IX因子? 在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽? 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰? 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化? 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化? 提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性? 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化 在大肠杆菌中表达外源基因 大肠杆菌表达载体分类 常用表达载体 各种融合蛋白表达载体 各种用于抗体识别的标记 有前景的特殊用途的tag 融合蛋白的专一性切割 特殊的表达用菌株 重要的原核表达质粒提供商 让表达产物可溶化 让蛋白质分泌到间质去 包含体来源蛋白质的复性 经常碰到的问题 是不是忘了加还原剂（DTT或巯基乙醇）？ 是不是在－20℃冻存过？ 用4M盐酸胍试试 是不是酸性蛋白质？ 是不是蛋白质的合成提前中止了？ （富含Arg, Ile, Leu, Pro这几种氨基酸） 可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或 RP 作宿主菌 (Stratagen)； 使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21, Novagen）以便纯化全长的融合蛋白 His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5 mM EDTA来去除重金属离子的干扰； His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）; 其他不明原因导致弱结合 * 有可能以后做到的事 按蛋白质类型分 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag,