花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因克隆及表达分析.docVIP

花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因克隆及表达分析 　　摘要：热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）和热激转录因子（heat shock factors.HSFs）在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的eDNA片段，通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列，根据序列信息设计引物，以花生叶片eDNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析结果显示，AhHSP70基因的ORF全为1 962 bp，编码653个氨基酸，分子质量为72.45 kD，理论等电点pl为4.93；AhHSF基因的ORF全长为1 212 bp，编码403个氨基酸，分子质量为46.03 kD，理论等电点pl为4.85。AhHSP70与AhHSF均不具有信号肽，为可溶性蛋白，二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对，并构建进化树进行亲缘关系分析，结果表明，AhHSP70与大豆GmHSP70亲缘关系较近，与番茄SlHSP70亲缘关系比较远；AhHSF与菜豆PaHSF亲缘关系较近，而与蒺藜苜蓿MtHSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对AhHSP70和AhHSF在热胁迫情况下的表达进行分析，结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高，AhHSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高，热处理24 h和48 h后，表达量为对照的 50倍和135倍；转录因子AhHSP在高温胁迫3 h后表达明显升高，高温处理6 h后达到最高，随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。 　　关键词：花生；热激蛋白；热激因子；基因克隆；序列分析；基因表达 　　中图分类号：S565.203.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）04-0001-07 　　收稿日期：2015-01-30 　　基金项目：国家自然科学基金项目；国家“863”计划项目（2013AA102602）；山东省生物资源创新项目；济南市科技创新项目（20l102033）；山东省自主创新成果转化专项（2012ZHZXIA0418） 　　热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一类进化保守的多肽，在机体受到高低温、干旱、盐渍、缺氧、机械损伤等多种环境胁迫时诱导合成[1]，其中高温足诱导HSPs合成的主要因素[2]，故又称应激蛋白或热休克蛋白。HSPs作为一种分子伴侣，能够及时将受热损伤的蛋白聚集，协助其肽链的折叠，促使其复性从而恢复体内正常蛋白的功能[3]。张建国等[4]研究发现，HSPs的积累水平与生物的耐热性呈显著正相关。热激因子（heat shock factors，HSFs）是生物体内调节热激应答的一类转录因子，主要存在于细胞核内，能激活或抑制基因的转录，在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要的作用[5]。 　　HSPs作为一类逆境胁迫蛋白，可以被多种逆境所诱导，并能够减轻胁迫引起的伤害，Lurie等[6]还发现HSPs蛋白具有交叉保护的功能。Tissieres等[7]首次在黑腹果蝇中发现热激蛋白HSPs，随后发现动物、植物、微生物都能合成HSPs。在生物体内热激蛋白有多种形式，例如泛索（ubiquitin）是一类组成型表达的热激蛋白，蛋白质二硫键异构酶（protein disulphide - isomerase，PID））也被认为是一种热激蛋白[8]。根据分子量大小的不同，可将HSPs分为5个家族，即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP[9]。其中HSP90具有调节作用，可作用于激素受体，保证受体呈无活性状态[10]。HSP70是HSPs家族中最为保守也是最重要的一类蛋白[11]，是目前研究最深入的一类蛋白，在依赖ATP的蛋白质折叠和装配中起作用。HSP70结构包括N端ATPase结合区以及C端多肽结合区，N端序列高度保守，具有结合并水解ATP的活性[12，13]。HSP60最早被称为分子伴侣，线粒体HSP60主要参与了核编码的线粒体蛋白质的加工、定位和装配，小分子HSP在热激及其恢复时，在细胞质、细胞核以及细胞器之间运动，保护细胞免受高温伤害，修补被损伤的蛋白。小分子热激蛋白N端序列在不同物种中差异较大，C端则高度保守[14]。植物热激蛋白可以在不同的器官中被诱导，可在根、茎、叶、种子以及幼苗中产生，也可在体外单个细胞中产生，此外，它们也可定位于不同的细胞器中。 　　典型的热激转录因子结构包括N端的DNA结合域（DBD）、寡聚化结构域（OD）、核定位信号（NLS）