苜蓿耐药根瘤菌筛选及荧光蛋白标记对根瘤菌耐药性影响.docVIP

苜蓿耐药根瘤菌筛选及荧光蛋白标记对根瘤菌耐药性影响 　　摘要：为明确荧光蛋白标记技术对根瘤菌耐药性的影响，采集6个品种的苜蓿根瘤进行根瘤菌的分离、纯化和初步鉴定，并筛选其中对3种稀土盐抑菌剂La（NO3）3?6H2O，LaCl3 和Ce（NO3）3?6H2O以及2种植物源抑菌剂苦参碱和除虫菊素具有耐受性的菌株，得到一株编号为LH3436的根瘤菌，对0.6 mg/mL苦参碱具有天然耐受性。将LH3436和对照根瘤菌R.12531以及参比根瘤菌R.GN5进行荧光蛋白标记后，观察其对抑菌剂耐受性的变化。发现各初筛菌株在无氮培养基上的生长状况对非根瘤菌的筛除率最高，所有初筛菌株均为革兰氏染色阴性的快生型产酸菌，全部难以利用柠檬酸盐，而可以利用蔗糖和可溶性淀粉，但对乳糖、葡萄糖和果糖等碳源的利用存在差异性；试验初筛菌株对植物源类抑菌剂的相对耐受性好，而对稀土盐类抑菌剂的相对耐受性差，将筛选根瘤菌进行荧光蛋白标记后，其对抑菌剂的耐受性未发生改变。 　　关键词：苜蓿根瘤菌；稀土盐类；植物源抑菌剂；筛选；耐药性 　　中图分类号：S 330.1；Q 945.7文献标识码：A文章编号2014 　　与自然存在的土著根瘤菌比，人工选育的根瘤菌常具有固氮效率高、促生效果好等优势。但释放到田间的目标根瘤菌，需要与环境中的土著根瘤菌以及其他影响目标菌结瘤的杂菌在营养、空间及宿主等方面进行竞争[1]。我国西北内陆土壤相对贫瘠的现状使得豆科牧草的根瘤菌接种效率低下[2]。目前多采用筛选抗性菌株的方法提高菌种适应性，以增加其在不同环境中的竞争能力。此外，所筛选的高效根瘤菌一旦投入生产，制成商业化产品根瘤菌剂后，还面临着贮藏期间因空气中杂菌入侵所导致的高污染率问题[3，4]。因此，常通过向菌剂中添加抑菌剂的措施降低菌剂污染率并增加其施用到田间后的竞争结瘤能力[5，6]。 　　对有关3种稀土盐抑菌剂La（NO3）3?6H2O，LaCl3和Ce（NO3）3?6H2O及2种植物源抑菌剂苦参碱，除虫菊素的研究发现[7，8]，上述抑菌剂均对空气和土壤源杂菌有较好的抑制效果。在此基础上明确所筛选根瘤菌对以上所说抑菌剂的耐受程度，对于制备高竞争型抗污染根瘤菌剂至关重要，同时也是后续菌剂制备工作进行的基础。有效选择对空气及土壤源杂菌抑制效果好、而对根瘤菌的选择毒性低的抑菌剂类型，可降低所制备菌剂的污染率并增加目的菌株施用到田间后的竞争效果。此外，针对根瘤菌研究中占瘤率测定难的现状，以研究方法检测灵敏度高、对试验材料无能源负担为基本原则[9]，对所筛选根瘤菌进行青色荧光蛋白（cfp）标记，并测定标记根瘤菌对抑菌剂的耐受性变化，以达到能够更加简单的识别目标根瘤菌，并降低后续工作的强度和技术成本的目的，以期为后期所接种根瘤菌回接效果以及所制备菌剂抗污染效果的测定提供数据支撑。 　　1材料和方法 　　1.1供试材料 　　1.1.1供试植物材料2012年6月，于甘肃农业大学兰州牧草试验站选取6个苜蓿品种。各苜蓿品种的根瘤分别取自多于3处栽培地的生长健壮、无病虫害、根瘤数多且颜色粉红的苜蓿植株。 　　1.1.2供试抑菌剂材料稀土盐抑菌剂La（NO3）3?6H2O，LaCl3 和Ce（NO3）3?6H2O，购自五矿（北京）稀土研究院有限公司，为常规农用稀土，具有抗炎、杀菌等药理活性。 　　表1苜蓿品种及来源 　　Table 1Plant varieties and origin 　　品种来源1.清水（Medicago sativa cv.Qingshui）甘肃2.WL168HQ （Medicago sativa cv.WL168HQ）美国3.WL343HQ （Medicago sativa cv.WL343HQ）美国4.甘农5号 （Medicago sativa cv.Gannong NO.5）甘肃5.甘农3号 （Medicago sativa cv.Gannong NO.3）甘肃6.陇东 （Medicago sativa cv.Algonquin）甘肃植物源抑菌剂，苦参碱和除虫菊素，购自宝鸡方晟生物开发有限公司，均为植物源杀虫剂。苦参碱主要以其生物碱成分发挥抑菌作用，对昆虫、病原菌的毒力较强，对人畜的选择毒性低；除虫菊素属神经毒剂，主要起触杀作用，对高等动物低毒，见光后可缓慢分解为水和CO，环保无公害。 　　1.2根瘤菌的分离与鉴定 　　1.2.1苜蓿根瘤的分离与处理将各品种苜蓿植株根系挖出后，以自来水淋洗根系表面附着的土壤和有机质，取下根系上颜色偏红和偏粉红的根瘤，置于无菌三角瓶中，加医用碘伏溶液震荡灭菌2 min后，以无菌水冲洗，重复上述过程3次。最后用无菌滤纸吸干根瘤表面水分待用。 　　根瘤表面处理药剂，医用碘伏消毒