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菊花叶片总RNA提取方法比较研究 　　摘要： 以菊花C008的叶片为试材，分别采用CTAB法、Trizol法、改良Trizol法和试剂盒法等进行总RNA提取试验，并对提取质量进行分析比较。结果表明：CTAB法提取的总RNA存在DNA污染。Trizol法提取的总RNA条带复杂，有蛋白等杂质污染。改良Trizol法提取的总RNA条带清晰，但RNA存在降解。试剂盒法提取的总RNA条带清晰，纯度更高，D260 nm/D280 nm为1.889，浓度为144.000 μg/mL，是适于菊花叶片总RNA提取的简单、高效的方法。 　　关键词： 菊花；总RNA；提取方法 　　中图分类号： S682.1+10.1 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）03-0067-02 　　菊花（Chrysanthemum morifolium）是中国十大传统名花和世界四大切花之一，也是园林绿化中的重要观赏植物之一，在现代花卉生产中占有重要地位，具有很高的观赏和经济价值。菊花白色锈病是菊花首要病害之一，在多个国家被列为检疫性病害[1]。寻找菊花中的抗病基因，对于防治该病具有重要作用。获得纯度高、完整性好的RNA是后期进行转录组测序、RT-PCR、基因克隆等分子生物学研究的基础。菊花的组织器官中含有大量的多糖、酚类、蛋白质等次生代谢物质，严重干扰了菊花总RNA 的提取质量[2]。目前，针对菊花叶片总RNA的提取有一些报道[2-5]，但仍不能提取出质量好的总RNA。本试验对4种常用的总RNA提取方法进行系统分析比较，发现试剂盒法对于菊花叶片总RNA的提取是一种简单、高效的方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　以沈阳农业大学花卉基地的菊花C008的叶片为试材，采后立即用锡箔纸包好，用液氮速冻后，在-80 ℃的超低温冰箱中保存备用。 　　主要试剂：CTAB缓冲液、10%β-巯基乙醇、氯仿 ∶异戊醇（CI，V ∶V=24 ∶1）、Trizol试剂、异丙醇、无水乙醇、DECP水、RNA prep Pure Kit试剂盒等。 　　试验所需的移液枪枪头、枪头盒均用0.1%DEPC水浸泡24 h，然后121 ℃高压灭菌30 min，50 ℃烘干备用。三角瓶、玻璃棒、量筒、研钵、研棒、钥匙用双蒸馏水清洗后180 ℃烘烤过夜。研钵、研棒、药匙在使用前需放入-20 ℃冰箱预冷。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 CTAB法 ①取0.2 g菊花叶片于液氮中迅速冷却充分研磨，将磨好的叶片迅速装入无RNase的2 mL离心管中，加入65 ℃预热的CTAB缓冲液（含10%的β-巯基乙醇） 1 mL，立即在振荡器上剧烈振荡30 s，65 ℃水浴锅中孵育 10 min，每3～5 min颠倒混匀1次，动作不要太剧烈。②加入等体积的氯仿 ∶异戊醇（CI，V ∶V=24 ∶1），用力颠倒混匀，4 ℃ 下12 000 r/min离心10 min。③取上清液于新的离心管中，加入等体积的CI，轻轻颠倒混匀，4 ℃下，12 000 r/min离心10 min。④取上清液于新离心管中，加入二倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 ℃沉淀30 min以上，4 ℃下12 000 r/min 离心20 min，去上清。⑤用提前预冷的75%乙醇洗涤沉淀1次，去上清，在超净工作台中吹干沉淀，加入 40 μL ddH2O水溶解沉淀。 　　1.2.2 Trizol法 参照吕晋慧等的方法[2]。 　　1.2.3 改良Trizol法 ①向1.5 mL离心管中加入1 mL Trizol 和20 μL β-巯基乙醇，混匀。称取0.2 g菊花叶片液氮研磨成粉末，转移至离心管中，混匀后，静置10 min，4 ℃下 12 000 r/min 离心5 min。②取上清，加入等体积的CI，混匀，4 ℃下12 000 r/min离心5 min。③重复步骤②2次。④取上清，加入等体积异丙醇，混匀，静置10 min，4 ℃下 12 000 r/min 离心10 min。⑤弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀2次，4 ℃下12 000 r/min离心10 min；弃上清，超净工作台吹干，加入40 μL ddH2O溶解沉淀。 　　1.2.4 试剂盒法 参照RNA prep Pure Kit试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）说明书。 　　1.2.5 总RNA完整性和纯度检测 取4 μL总RNA样品在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压150 V电泳10～15 min，电泳后用凝胶成像系统拍照记录。取1 μL总RNA样品，用紫外分光光度计测定波长在260 nm和280 nm下的吸光度（以试验中溶解总RNA的ddH2O作为空白对照进行调零），计算总RNA样品浓度及RNA产量。 　　2 结果