实验二 DNA的重组连接.docVIP

实验二 DNA的重组连接 一、实验目的 用T4DNA连接酶将载体pBR322 EcoR Ⅰ-CIP处理的DNA片段，与目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。 二、实验原理 重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。 （一）DNA连接酶的作用步骤 1．T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物（腺苷酰酶） 2．酶－AMP复合物再结合到具有5′-磷酸基和3′-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 3．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 （二）DNA的连接方式 在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。 连接的方式有： 1．自连 2．两种片段相连 3．三个片段以上的自连与互连 （三）连接反应的条件 1．缓冲液：一般商品酶都带有10倍的缓冲液，有Mg2＋、ATP作为辅助因子，提供能量，同时也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清蛋白）维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。 2．温度：连接反应温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，EcoR Ⅰ