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聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 格里菲斯用肺炎球菌做实验时发现了一个令人惊异的现象： 加热杀死的能致病的S型菌＋不能致病的R型菌→混合→注射到小鼠体内→小鼠病死→从死鼠体内分离出大量的S型肺炎球菌 难道S型致病菌复活了吗？这就是著名的“格里菲斯之谜”。 中心法则及其发展 中心法则阐述的基因两大基本属性： 复制：DNA→DNA； 表达：从DNA→mRNA→蛋白质； 中心法则的补充： ?RNA的反转录 ?RNA的自我复制 ?DNA指导的蛋白质合成 * * 从DNA到染色体水平的压缩过程 基因是细胞内遗传物质的结构和功能单位，是以脱氧核糖核酸（DNA）的化学形式存在于染色体上。 “死菌复活”之谜 James Dewey Watson （ 1928～） Francis Harry Compton Crick （ 1916～） 1953年，DNA双螺旋结构模型被提出来了，两位创立者是美国生物化学家沃森（James Dewey Watson，1928～）和英国生物物理学家克里克（Francis Harry Compton Crick，1916～）。获1962年的诺贝尔生理学医学奖。 A structure for deoxyribonucletic acid (Nature 1953;171:737 ) 富兰克林拍摄的DNA晶体的X射线衍射照片，这张照片正是发现DNA结构的关键 基因的复制： 1.互补性 2.半保留性 3.半不连续性 基因的表达： 1.转录 （1）戴帽 在premRNA 的5`端加一个7-甲基鸟 嘌呤核苷酸 （2）加尾 在RNA转录 本的3` 端加上200个 左右的AMP，形成 PolyA尾 （3）剪接 2.翻译 从1857年孟德尔进行豌豆杂交实验算起，经过无数科学家近百年的探索，蒙在生命遗传奥秘上的面纱正在一层层地剥去。 　科学探索的道路是螺旋式的，科学家们在阶梯上不断攀登，一个新的螺旋展现在他们的眼前，而这将引起一场生命科学的革命。 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR反应体系与反应条件 PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 标准的PCR反应体系： 　　? 10×PCR buffer 　 10ul 2.5ul 　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L 0.5ul(10mM) 　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　 1.25ul(10uM) 　　　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　 　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 0.5ul 　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L 1.5ul(25mM) 　　　加双或三蒸水至 　100ul 加水至25ul 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 :Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA