间断性高浓度胰岛素对HUECV304细胞iNOS蛋白表达影响.docVIP

间断性高浓度胰岛素对HUECV304细胞iNOS蛋白表达影响 　　【摘要】目的 研究体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUECV304）在间断性高浓度胰岛素与持续性高浓度胰岛素作用下诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白的不同表达，从而进一步研究间断性高浓度胰岛素血症导致动脉粥样硬化的原因及发病机制。方法培养人脐静脉内皮细胞（HUECV304）为实验对象，研究间断性高浓度胰岛素对血管内皮细胞iNOS蛋白表达的影响。分为四组进行实验，即间断性高浓度胰岛素波动组（含100 nmol/L胰岛素的细胞培养液及含1 nmol/L胰岛素的细胞培养液轮换，每隔8小时更换一次）、持续性高浓度胰岛素组（含100 nmol/L胰岛素的细胞培养液）、含正常浓度胰岛素组（含1 nmol/L胰岛素的细胞培养液）、阴性对照组（不含胰岛素的细胞培养液）；再依次更换新鲜条件细胞培养液（每次培育8小时后），四组细胞均培育72小时。采用免疫细胞化学法检测内皮细胞iNOS蛋白表达。结果四组内皮细胞经含不同浓度胰岛素的培养液培养72小时后，结果表明：正常浓度胰岛素组、间断性高浓度胰岛素组、持续性高浓度胰岛素组的内皮细胞iNOS蛋白的表达水平均不同程度地增高，分别为对照组的1.92倍（P0.001）、4.52倍（P0.001）、3.31倍（P0.001），其中以间断性高浓度胰岛素组增高幅度尤为明显，高于持续性高浓度胰岛素组（P0.001）。结论相对于持续性高浓度胰岛素，间断性高浓度胰岛素更能增强人脐静脉内皮细胞iNOS蛋白的表达，提示间断性高浓度胰岛素可能通过影响血管内皮细胞iNOS蛋白表达途径而损伤血管内皮的功能，从而促进糖尿病血管并发症的进一步发展。 　　【关键词】 间断性高浓度胰岛素；人脐静脉内皮细胞；诱导型一氧化氮合酶；蛋白表达 　　中图分类号：R587.3 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn2015.01.003 　　高胰岛素血症是国内外糖尿病及高血压患者因心血管疾病死亡的重要原因[1，2] 。目前认为糖尿病患者发生动脉粥样硬化的危险性与高血糖、高胰岛素血症、异常脂血症等众多病理因素有关。有临床研究表明在肥胖和超重儿童中有高胰岛素血症者占总人数的44.7%[3]。因为胰岛素抵抗而产生随之而来的高胰岛素血症存在于许多疾病中，是糖尿病早期的症状之一[4]。而且基础动物研究发现，使孕期怀孕大鼠血压升高的主要原因为高胰岛素血症[5]。但高胰岛素血症如何导致动脉粥样硬化发生的病理机制至今尚未完全阐明。目前许多学者认为内皮细胞功能受损是众多血管性疾病发生的始动步骤。因此，深入开展高胰岛素血症致内皮功能损伤机理的研究将有利于进一步阐明糖尿病动脉粥样硬化的发病机制。有研究表明：通过免疫炎症反应高浓度胰岛素参与动脉粥样硬化的发生[6]。鉴于内皮细胞一氧化氮（NO）分泌的异常变化是内皮细胞受损的最早期表现并且加入炎症反应，且诱导型一氧化氮合酶（iNOS）与炎症反应相关。考虑糖尿病（2型）是一种慢性炎症性疾病，很多炎症因子加入2型糖尿病的发生及其并发症的发展[7，8]。所以我们研究含不同高浓度胰岛素形成的间断性高浓度胰岛素培养液培养下的内皮细胞iNOS蛋白水平表达，与含持续性高浓度胰岛素细胞培养液培养下的内皮细胞iNOS蛋白水平表达有何不同的影响，旨在进一步探索间断性高胰岛素血症促进动脉粥样硬化发生及发展的病理生理机制，进而为糖尿病血管并发症的防治及胰岛素的合理应用开辟新的途径。1材料与方法1.1实验材料和试剂 自通化东宝药业股份有限公司购重组人胰岛素（甘舒霖R）；自中南大学湘雅医学院细胞典藏中心购内皮细胞株（HUECV304）细胞；自杭州四季青公司购胎牛血清（FBS）和新生牛血清；自Gibco公司购DMEM细胞培养基（低糖型）；其他试剂均为国产分析纯产品。 　　1.2实验方法和步骤 　　1.2.1内皮细胞的传代培养及鉴定先将HUECV304放入含5%二氧化碳的37℃（持续恒温）细胞培养箱内培养。等待细胞长成亚融合状态时，再用1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞3～5 min，待细胞消化至皱缩、彼此分离抑或呈大片状分离形态时即吸去消化液，再滴入适当量的含20%胎牛血清的细胞培养液用来终止细胞消化。然后，将大片状分离细胞吹打成单细胞悬液，待计数后用无菌吸管按1×105/ml等量吸取细胞至新的细胞无菌培养瓶中继续培养，将细胞静止培养4～6小时，待细胞固定后再更换培养液，用倒置相差显微镜观察新生代细胞的形态特点。用Ⅷ因子抗原免疫细胞化学检测（+）方法鉴定实验细胞为内皮细胞株，待细胞生长至80%融合后，取生长状态好的对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2实验分组及处理取生长良好的对数期内皮细胞用于实验，待细胞接近融合时，为了使细胞同步，四组