《蛋白质组学基本原理》.ppt

三、蛋白质的分离与二维电泳技术 (一) 二维电泳的基本原理 根据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（IEF），在第二方向按照分子量大小进行SDS分离（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）。 1D-SDS一 原理 在1D-SDS中，蛋白质样品溶解在通常含有巯基还原剂（巯基乙醇或DDT)和SDS的上样缓冲液中。 SDS与蛋白质结合，以与分子质量约恒定的比例将负电荷（来自SDS硫酸基团）传递给蛋白质。高电压下，蛋白质- SDS复合物在交联的聚丙烯酰胺凝胶上迁移，其速度取决于它们穿越凝胶孔基质的能力。蛋白质按照分子质量次序分离形成条带。 二 1D-SDS的局限性 用1D-SDS得到的分离度是相当有限的，显示 含有单一蛋白质的条带实际上可能含有多种蛋白质分子。 2D-SDS一 两种分离方法的结合 1）根据等电点用IEF分离蛋白质； 2）在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离聚焦的 蛋白质。 2D-SDS在第一向电泳根据等电点的不同， 第二向电泳根据分子质量的不同分离蛋白质。 二 新式2D-SDS新系统使用固相PH梯度（IPG)胶条和相对简单的硬件，能很容易的从IPG胶条将蛋白质转移到SDS平板凝胶中。在固相PH梯度中，聚羧酸两性电解质固定在支持物上，产生可重复的PH梯度。 三、 2D凝胶分离蛋白质的染色 通过2D凝胶分离蛋白质的显色使用通常的染色技术，包括银染、考马斯亮蓝和酰胺黑染色。银染和新的荧光染料是最灵敏的。 五 2D-SDS存在的问题 1）进行可完全重复的2D-SDS分析是困难的。 2）某些蛋白质不适于进行第一维IEF步骤。许多较 大的疏水蛋白质在这种类型的分析中结果不理想；由于蛋白质存在不同等电点的多种形式，蛋白质的IEF常把蛋白质分离成许多不连续的条带。 3）作为检测技术的蛋白质染色的动态范围相对较小。点密度最多能反映100倍的蛋白质浓度范围。 2、二维电泳分辨能力传统的二维电泳最好条件下20cm × 20cm的胶理论上可分辨10,000个蛋白点（各个方向100点）,实际上只能分辨3000个点. 3、二维电泳可提供的数据 二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天星”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。 四、蛋白质的检测技术 （一）考马氏亮蓝染色 考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20 mg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。 （二）银染1、原理：二维凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后浸泡在银盐溶液中，蛋白与Ag+络合，凝胶空白背景中Ag+结合不牢而被冲洗，然后在酸碱环境中络合的Ag+被还原成金属银，蛋白点上金属银被曝光显示棕黄色或棕黑色。 (三)负染 1、原理（锌-咪唑染料） 咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式 沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固， 留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域， 就是负染过程。  （四）荧光染色1、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。  五、蛋白质序列测定和生物 质谱技术 MALDI: Practical Considerations Laser wavelength and power density Nitrogen lasers (337 nm) are standard but other lasers are also used High laser power induces more fragmentation and loss of mass resolutio