《第七章 高通量基因组测序技术介绍11-25(1)》.ppt

454 高通量测序法 结合了DNA扩增的乳胶系统（emulsion system）和焦磷酸测序的方法, 即一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术; 在DNA聚合酶, ATP硫酸化酶, 荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下, 将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 。通过检测荧光信号释放的有无和强度, 就可以达到实时测定DNA序列的目的。 454 高通量测序法优势 宏基因组测序 宏基因组测序是对某一特定环境，如肠道、土壤、海水等中的所有微生物进行基因组测序。通过此方法可对该环境中的微生物种类和优势物种进行检测，揭示微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系 。自然环境中很多微生物无法分离培养，而此方法无需对微生物进行分离培养。 宏基因组测序方法现在有全基因组的宏基因组测序和16S/18S rRNA宏基因组测序。 全基因组的宏基因组测序 通过高通量测序技术，对环境样品的总 DNA 直接进行全基因组的宏基因组测序，能够实现微生物群落的物种分类研究、群落结构、系统进化、功能注释以及物种间的代谢网络研究，挖掘具有应用价值的基因资源，开发新的微生物活性物质。与传统的 Sanger法相比，速度快，性价比高，周期短，单个样品的测序量可以接近饱和。 宏基因组测序信息分析主要内容 拼接组装 物种分类组成分析 基因预测和功能注释 生成Profiling table 主成分分析（PCA） 筛选与样品分组显著相关的因子 多样品间比较分析 16S/18S rRNA宏基因组测序 16S/18S rRNA是微生物群落分析和细菌进化研究以及分类研究最常用的靶分子，采用新一代测序技术，对16S/18S rDNA的可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，能全面的反映微生物群体的物种组成，真实的物种分布及丰度信息。 16S/18S rRNA测序信息分析内容 物种分类、物种丰度分析 OTU（Operational?Taxonomic Units ）分析 多样性分析 系统进化分析 多样品间的比较分析 无参考序列转录组测序案例 Crawford JE, Guelbeogo WM, Sanou A, Traoré A, Vernick KD, et al. (2010)?De NovoTranscriptome Sequencing in?Anopheles funestus?Using Illumina RNA-Seq Technology. PLoS ONE 5(12): e14202. doi:10.1371/journal.pone.0014202 此研究通过对3个按蚊样品进行高通量测序，通过拼接组装后，和相近物种进行比较基因组学分析。 De novo 序列拼接、组装和比对流程 拼接结果统计 拼接和变异检测分析流程图 比较基因组分析 各类功能基因中氨基酸在物种间差异比例 差异同源蛋白GO分类 进化关系分析 电子表达谱测序 对特定处理条件下的全基因组基因表达谱进行分析，已被广泛用于功能基因组学和医学等研究领域。 电子表达谱测序（Digital Gene Expression, DGE）又称为基因表达标签测序（mRNA tag profiling），其原理是通过两种酶切作用对基因中一段长度为21nt的序列标签进行测序。由于其测序只针对表达的基因进行测序，产生的数据量相对较小，是研究基因表达谱的经济而快速的研究手段。 又称Tag-SAGE 电子表达谱测序流程图 NlaIII限制性酶切 电子表达谱分析内容 图像识别与原始碱基数据读取。 去污染、去接头，标签序列计数统计。 基因组比对与统计，基因序列比对获得所表达的基因列表 基因差异表达分析。 聚类与表达类型分析。 GO基因富集与分类分析。 Pathway富集与分类分析。 蛋白相互作用网络分析。 反义链转录本与新转录本检测。 电子表达谱测序案例分析 Morrissy AS, et al. Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling. Genome Res. 2009. 19 (10): 1825-1835. 此研究用高通量电子表达谱测序（Tag-SAGE）和传统LongSAGE测序方法对癌症细胞进行研究，比较两种方法效果，揭示了电子表达谱在基因发现中的诸多优势，可发现更多的基因，减少GC偏好。 两种方法所检测到的基因数比较 小RNA测序 小 RNA是指长度在21-31nt的内源性非蛋白质编码RNA，广泛存在于高等和低等生物体内，其对mRNA的转录及转录后水平等生命过程起到调节作用。 现已知小RNA可归纳成三类：微RNA (miRNA)，小干扰RNA(