青蟹杂交种的分子鉴定论文（毕业学术论文设计）.docVIP

PAGE PAGE \* MERGEFORMAT 15 青蟹杂交种的分子鉴定研究 摘要：种间杂交是提高青蟹养殖效益的重要环节，目前尚无鉴定青蟹杂交种的可靠方法。本文利用分子技术鉴定锯缘青蟹和拟穴青蟹两个种间的杂交种，旨在为青蟹的杂交优势利用提供技术支持。采用PCR扩增技术对锯缘青蟹与拟穴青蟹种间繁殖的F1代个体的16SrRNA和COI基因片段进行了扩增和测序，分别得到了长度为532和628bp的片段。通过统计变异位点 、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数，分析比较子代中各体的序列差异，鉴定出了锯缘青蟹和拟穴青蟹的杂交种。这些资料将为研发青蟹优良品种提供新的依据。 关键词：锯缘青蟹；拟穴青蟹；杂交种；分子鉴定 青蟹隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae),是一种分布于印度-西太平洋沿岸的经济蟹类,在我国北起江苏连云港,南至海南岛均有分布。青蟹初期被认为只有1属1种,不同的种名都属同物异名[1]。后来，Estanpador[2]将其鉴定为3个种:S.serrata、S. tranquebarica、S. olivacea,其观点得到了Serene[3]的支持。而Stephenson[4,5]认为青蟹属种群之间的差异尚未达到种间水平。Radhekrishra等[6]、Jeel等[7]将印度海域的青蟹定为2个种:S. serrata、S. tranquebarica。可见该属蟹类的分类一直存在争论。目前的研究结果表明[8,9],青蟹属内共有4个种:S. serrata(锯缘青蟹)、S. tranquebarica(紫螯青蟹)、S. paramamosain(拟穴青蟹)、S. olivacea(榄绿青蟹),位于我国香港和厦门的青蟹为S.paramamosain(拟穴青蟹)。近年来,我国许多科研工作者致力于青蟹的繁育及人工养殖[10—14],而对青蟹属的分类研究报道不多,戴爱云等[15]只记载了青蟹属的一个种,即锯缘青蟹(S.serrata)。黎中宝等[16]进行了中国东南沿海锯缘青蟹(S.serrata)群体的形态判别分析。王玉江等[17]比较了中国和越南青蟹(S. paramamosain)线粒体16S rRNA基因序列。高天翔等[18]对采自泰国,马达加斯加,日本的3种青蟹进行了线粒体12SrRNA基因片段序列分析,认为分属3种不同青蟹。马凌波等[19],高天翔等[20]分别分析了我国沿海不同地区青蟹的线粒体COI基因序列和线粒体12S rRNA基因序列,结果显示不同地区青蟹都与S. paramamosain相似。动物线粒体DNA(mtDNA)具有分子量小、母性遗传及比核基因DNA进化速度快等特点,已被广泛应用于进化生物学研究中[21,22]。国外学者对4种青蟹mtDNA 16S rRNA和COI基因进行了测序分析[9][23]。目前国内外对青蟹的研究大多是青蟹的分类，而对青蟹杂交种鉴定方面研究甚少。而本课题是在前者研究分类的基础上，利用现代分子技术鉴定青蟹杂交种，为以后的研究提供理论依据和现实的参考。 1　材料与方法 1.1　实验材料 取锯缘青蟹（购自海南三亚水产市场，经鉴定符合品种要求）和拟穴青蟹（购自福建厦门水产市场，经鉴定符合品种要求）各五十只，在适宜的条件下，抱对、孵化，直至产生一定量的子代青蟹。取子代的青蟹品种，实验待用。 1.2　实验方法 1.2.1　基因组DNA的提取与检测 从子代青蟹群体中随机选8～10个个体,每个个体取约100 g螯足肌肉,剪碎组织,加入475μL组织匀浆缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0;50 mmol/LEDTA,pH8.0),充分混匀,依次加入终浓度为10%的SDS和20μg/mL的蛋白酶K,55℃裂解至澄清。采用苯酚-氯仿法提取基因组DNA[24]。用DNA定量仪测定样品DNA的浓度和纯度,-20℃保存备用。1%琼脂糖凝胶电泳检测,GeneFinder染色,全自动凝胶成像系统拍照。 1.2.2　16sRNA和COI基因的PCR扩增 16S rRNA基因片段扩增，引物见下表1。PCR反应总体积为25μl,其中含模板DNA 50～100 ng,10×PCR buffer 2.5μL,上、下游引物各0.12μmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,MgCl22 mmol/L,Taq酶1 U[1]。在热循环仪(Bio-Rad)上进行PCR反应: 94℃预变性2 min;94℃变性45 s,48℃退火1 min,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min。 表1　所用引物序列 Tab.1　Sequences of used primers 引物