土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及鉴定--毕业论文设计.docxVIP

PAGE \* MERGEFORMAT 21 土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及鉴定 广州大学 生命科学学院 姓名：张宣琪 班级：生技121班 学号：1214300094 同组组员：徐婷婷 刘海伦 张黎明 崔仁洪 叶毅航 一、摘要 本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰式细菌学手册鉴定其种属。 实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定，鉴定结果为蜂房芽孢杆菌。 二、关键词：淀粉酶 芽孢杆菌 生化鉴定 三、实验材料与方法 1、实验材料 1.1土样的采集 选取广大梅苑公寓楼下花园、广大生化楼前小河附近两处的土壤，五点法采集，边长15cm。铲去表层土，取10cm深土壤，每一个土样约25g 左右（每个点5g）。将土样放入无菌的纸袋中,并记录采集的时间、地点、植被类型,4 ℃冰箱中保存备用。分别记做A土样、B土样。 1.2培养基 淀粉筛选培养基 淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml, pH 自然。 斜面种子培养基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4； 蛋白胨液体培养基（作吲哚实验用） 蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4，121℃ 灭菌20 min； 葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用） 蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4，121℃ 灭菌20 min； 糖发酵培养基（作糖酵解试验用） 蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0.2 g，1%溴麝香草酚蓝水溶液3 ml，待试糖10 g(一般糖或醇按1 % 量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 % 的量加入)，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4； 酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用） L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板； 酪素平板（作酪素水解试验用） 取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板； 西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用） 柠檬酸钠2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H20 0.2 g, K2HPO4·3H20 1 g,(NH4)2HPO4 1 g, 1%溴麝香草酚蓝水溶液10 ml，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.0 , 121℃ 灭菌20 min； 淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 可溶性淀粉2 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4； （2%、5%、7%）高盐培养基（做耐盐试验用） 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl（ 2g、5g、7g），琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4； 明胶培养基（做明胶液化试验用） 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明胶12g，蒸馏水1000 mL ，pH 7.0； 半固体培养基（作运动性实验用） 琼脂含量0.5%，其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制； 1.3试剂和仪器 1.3.1试剂 耐盐性试验：NaCl粉末。 糖酵解实验：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇。 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。 芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。 V.P试验（MR试验）：40%NaOH 溶液，ɑ-奈酚。 吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。 碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL。 单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红。 硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）； 酪素水解：脱脂奶粉。 酪氨酸水解：L-酪氨酸。 溶菌酶抗性实验：溶菌酶。 卵黄反应：新鲜鸡蛋。 硝酸盐试验：硝酸盐 明胶液化试验：明胶 柠檬酸盐利用试验：西蒙斯氏柠檬酸盐 1.3.2仪器： 无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸，涂布器，显微镜，移液管，移液枪等。 恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，恒温