11dna重组技术的基本工具_2.pptVIP

转基因抗虫棉 磷酸二酯键 什么叫平末端？ ⑴DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 ⑵DNA聚合酶是以DNA一条链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的子链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 问题探讨： ①限制酶从哪里寻找？ 提示：联想以前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？ 原核生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 ②迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 是因为微生物在长期进化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵． 将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子, 是靠DNA连接酶来完成的。 1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条DNA链连接起来的酶，称之DNA连接酶。 根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coliDNA连接酶;另一类是从T4噬菌体中分离出来的,称为T4DNA连接酶。 这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别： E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。 （二） “分子缝合针” —— DNA连接酶 1、种类： 两类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。 2、作用部位： 基因工程中所用的连接酶有两种：一种是E·coliDNA连接酶。另一种是T4DNA连接酶。这两种连接酶都是连接双链DNA的缺口，不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？ DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 不是。 二者虽然化学本质都是蛋白质，但组成和性质各不相同。 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？ 导入过程需要运输工具——载体。 载体的作用有哪些？ 作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。 作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。 三、 基因进入受体细胞的载体——  “分子运输车” 用什么方法才能将外源基因（目的基因）送入受体细胞中呢？ 质粒是基因工程最常用的载体。 最常用的质粒是大肠杆菌质粒。 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小双链环状DNA分子。 质粒DNA上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。 质粒DNA上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨卞青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 在基因工程使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别。 这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。 将外源基因送入受体细胞。 1、作用： 2、条件： ⑴能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ⑵载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。 ⑶具有某些标记基因，便于进行筛选。 ⑷载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害。 ⑸载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作。 3、