高浓度氢气对大鼠全脑IR损伤海马CA1区神经元及小胶质细胞影响.docVIP

高浓度氢气对大鼠全脑IR损伤海马CA1区神经元及小胶质细胞影响 　　摘要：目的：观察吸入高浓度氢气对大鼠全脑缺血再灌注（I/R）损伤海马CA1区神经元细胞及小胶质细胞的影响。方法：雄性SD大鼠75只，采用随机数字法分为3组，假手术（SH）组15只，采用电凝双侧椎动脉，仅暴露双侧颈总动脉但不夹闭；模型（4vo.con）组30只，用4血管阻断法（4-VO）建立全脑I/R损伤模型，再灌注同时吸入67%N2，33%O2；氢气治疗（4vo+H2）组30只，造模后再灌注同时吸入67%H2，33%0：，3 d和5 d后，观察、分析海马CA1区神经细胞形态和数量。结果：模型组海马CA1区神经元排列疏松、明显变性、细胞核固缩，大量尼氏小体丢失。氢气治疗组海马cAl区神经元稍有疏松，细胞结构相对完整，尼氏小体细胞数量减少，病理学损伤较模型组明显减轻。氢气治疗3 d或5 d后，神经元数量比模型组多，但低于假手术（SH）组，差异有统计学意义（P0.05）；小胶质细胞数量多于假手术组，但低于模型（4vo.con）组，差异有统计学意义（P0.05）。结论：再灌注同时吸入高浓度氢气对大鼠全脑I/R损伤海马CAl区神经元可产生明确保护作用，其机制可能是氢气抑制I/R后小胶质细胞的活化增殖。 　　关键词：氢气；全脑I/R；神经元；小胶质细胞 　　中图分类号：R743 文献标志码：A 文章编号：1008-2409（2016）01-0001-05 　　临床上将脑卒中分为缺血型与出血型，缺血型约占脑卒中的80%。目前没有脑卒中的有效治疗方法，因此患者的病死率和致残率高。小胶质细胞为脑内的主要免疫效应细胞，在脑缺血损伤中发挥脑保护和神经毒性双重作用。近年来证实氢气可通过抑制氧化应激、减少炎症反应以及减少细胞凋亡等机制发挥神经保护作用。笔者采用大鼠全脑I/R损伤模型，研究氢气（H2）对全脑I/R后海马CAl区锥形神经元细胞以及小胶质细胞的影响。 　　1.材料与方法 　　1.1动物分组 　　成年健康雄性清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠75只，体重为（280+20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。采用随机数字法分为3组，假手术（SH）组15只，采用电凝双侧椎动脉，仅暴露双侧颈总动脉但不夹闭；模型（4vo.con）组30只，再灌注同时吸人67%N2，33%O2，早晚各1次，每次2 h；氢气治疗（4vo+H2）组30只，再灌注同时吸入67%H2，33%O2，早晚各1次，每次2 h。3 d后，各组分别取7，15，15只实验大鼠，深麻醉后取脑组织置4%的多聚甲醛中固定。5 d后，采用同样方法采集其余的实验大鼠标本。 　　1.2大鼠全脑I/R损伤模型的建立 　　采用4-VO法制造大鼠全脑I/R损伤模型。麻醉后，将大鼠俯卧位固定，颈后正中切口，暴露左右两侧的翼突孔，插入电凝笔电凝椎动脉。改仰卧位固定，颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线留置备用。术后24 h，清醒状态下仰卧位固定，沿前日留置线暴露双侧颈总动脉，夹闭双侧颈总动脉7 min后，松开微动脉夹恢复脑血流并行再灌注3至5 d。双侧颈总动脉夹闭后大鼠60 s内昏迷，翻正反射消失、双侧瞳孔散大、能自主呼吸为模型成功标志，以判断是否发生全脑缺血。颈总动脉夹闭2 min内未昏迷、瞳孔不散大者、缺血后出现痉挛或者发生癫痫者弃之。SH组电凝双侧椎动脉，仅暴露双侧颈总动脉，不夹闭双侧颈总动脉。实验过程中，用电热板加热维持大鼠直肠温度在37℃左右直到恢复活动。 　　1.3尼氏染色 　　石蜡切片厚4um，烘干后，无水乙醇脱水，二甲苯脱蜡，无水乙醇，95%乙醇，90%乙醇，85%乙醇，蒸馏水各5 min，甲酚紫染15～20 min，85%乙醇褪色，95%乙醇，无水乙醇两遍，二甲苯两遍，各5 min，中性树胶封片。Leica正置显微镜（上海徕卡仪器有限公司，型号DM 750），高倍镜下（x400）观察海马CA1区内神经元细胞的形态。 　　1.4免疫组织化学染色 　　冰冻切片厚25 um，采用漂片法预染NeuN和IbM（abeam公司，英国）。步骤：经PBS冲洗后以PBS：甲醇：H2O2=5：4：1的溶液去除组织内源性非特异性过氧化物酶；0.1%的Triton X-100，5 min；封闭液封闭1 h，加入一抗NeuN（鼠抗）和Ibal（兔抗），放4℃冷室摇床过夜；然后按免疫组织化学技术操作步骤进行DAB染色、裱片、脱水和封片。Leica正置显微镜下观察海马CA1区神经细胞形态和计数，每张切片随机选3个高倍视野（x400），对海马CA1区阳性染色细胞计数。均采用单盲法。 　　1.5统计学分析 　　实验数据采用SPSS 18.0软件统计分析。计量资料用均数±