断乳至性成熟期持续暴露大豆异黄酮对卵泡发育的影响及其代谢组学分析-药理学(生殖毒理)专业论文.docx

断乳至性成熟期持续暴露大豆异黄酮对卵泡发育的影响及 其代谢组学研究 中文摘要 大豆异黄酮是大 豆 等 豆 科 植 物 生 长 过 程 中 形 成 的 植 物 化 学 物 ， 是 一种植物雌激素，流行病学和动物实验显示大豆异黄酮对人类有很多益处，如 预防癌症，防治心脑血管疾病，改善更年期综合征等。但鉴于未成年体内雌激 素水平较低和下丘脑-垂体-性腺轴发育的不完善，使得他们对外源性雌激素高 度敏感。因此大豆异黄酮的雌激素样作用对其内分泌产生干扰作用的机会较 大。目前对大豆异黄酮的生殖发育毒性国内外做了一些研究，但大部分的研究 主要集中在大豆异黄酮的外源性雌激素样效应上，如对子宫、阴道、乳腺等雌 激素效应器官的影响。而对于内源性雌激素的产生器官卵巢的影响研究极少， 且缺乏深入的分子机制研究。基于以上研究现状，本研究建立 Wistar 大鼠断 乳致性成熟期持续暴露大豆异黄酮的动物模型，研究大豆异黄酮对卵巢发育的 一般影响，对卵泡液微环境成分影响的代谢组学变化，对卵巢细胞凋亡及 Fas 及 Bcl-2/Bax 信号途径在大豆异黄酮诱导卵泡细胞凋亡中的调控作用。研究结 果对于明确大豆异黄酮未成年卵泡发育毒性及其机制以及未成年女性含大豆异 黄酮的豆类及其制品的安全推荐量的制定具有重要的指导意义。 目的： 研究断乳至性成熟期持续大豆异黄酮对卵巢发育的一般影响。进一步采用 代谢组学（HPLC-MS）技术研究断乳致性成熟期持续暴露大豆异黄酮大鼠卵巢卵 泡液内源性代谢物的变化，筛选出差异代谢标记物。进而探讨大豆异黄酮对卵 巢颗粒细胞凋亡的影响及 Fas 和 Bcl-2/Bax 信号通路在其中的调控作用。为大 豆异黄酮未成年女（雌）性性腺生殖发育干扰作用的预防与控制以及未成年女 性含大豆异黄酮的配方制剂和豆类食品安全摄入量的制定提供科学依据。 方法： 1.清洁级雌性 Wistar 大鼠 80 只，21 日龄，45±5g,按体重随机分为 4  组，每组 20 只，以 0、50、100、200mg/kg.BW 的大豆异黄酮灌胃，每天 1 次, 直至第 80 日龄，共灌胃 59 天。每天记录体重，观察阴门开放时间和动情周 期，干预结束后于动情期剖杀大鼠，取血测定血清雌二醇和孕酮。取卵巢、子 宫称重。取卵巢固定、包埋、切片、HE 染色计数各级卵泡，计算构成比。 2.采用显微注射技术提取上述动物模型中右侧卵巢有腔卵泡的卵泡液，每 3 只卵巢卵泡液混在一起收集为 1 份，约 15μL ，每组 6 份 。 经 离 心 、 甲 醇抽提， HPLC-MS 检测，色谱和质谱数据经适当降维，去噪。采用主成分分析 法（PCA）和偏最小二乘判别法（PLS-DA）进行模式识别，根据变量权重重要性 排序值（VIP）和数据库筛选差异代谢标记物，并用标准品进行验证。 3.每组随机抽取 2 个卵巢组织用于透射电镜观察细胞凋亡。取上述研究内 容“1”中的切片用 TUNEL 法检测细胞凋亡。每组随机抽取 6 个卵巢组织采用 real time-PCR 检测 Caspase-3、8、9、Fas 及 Bcl-2、Bax mRNA 表达，剩下的 每组 6 个卵巢组织采用 Western-blot 法测定 Caspase-3、Fas、Bcl-2 及 Bax 蛋 白表达水平。 结果： 1.大豆异黄酮对卵巢发育的一般影响：（1）与对照组相比，大豆异黄酮剂 量组体重无明显差别，卵巢和子宫脏器系数无明显差异（P＞0.05）。（2）与 对照组相比，高剂量组阴道开放时间明显提前（P＜0.05），各剂量组动情周期 无明显变化（P＞0.05）。（3）与对照组相比，高剂量组血清雌二醇明显降低 （P＜0.05），各组间孕酮水平差别无显著意义（P＞0.05）。（4）与对照组相 比，中高剂量组闭锁卵泡和黄体比例明显升高（P＜0.05），而原始卵泡和初级 卵泡明显减少（P＜0.05）。 2.大豆异黄酮对卵泡液影响的代谢组学研究：（1）总离子色谱图：肉眼上 看大豆异黄酮剂量组与对照组有些差别。（2）PCA 分析：经数据降维和去除噪 音，1300 多个峰被识别，在 PCA 得分散点图和 3D 图上各剂量组与对照组差别 明显。（3）PLS-DA 分析：在 PLS-DA 得分散点图和 3D 图上可看到各剂量组之 间以及与对照组之间差异很明显。（4）经 VIP 和数据库检索以及标准品验 证，共筛选出 24 个差异代谢标记物，涉及性激素代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代  谢以及能量代谢途径。 3.大豆异黄酮对卵巢颗粒细胞凋亡的影响及 Fas 和 Bcl-2/Bax 信号通路的 调控作用研究：（1）透射电镜发现大豆异黄酮剂量组颗粒细胞凋亡增多，且存 在明显的脂肪变性。（2）TUNEL 法检测发现高剂量组有腔卵泡的凋亡率显著高 于对照 组