水稻原生质体的分离及转化-Bio-protocol.PDF

/e1010125 DOI:10.21769/BioProtoc.1010125 水稻原生质体的分离及转化 Isolation and Transformation of Rice Protoplasts 江云鹤，程珂，赵晓波，欧阳亦聃* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：diana1983941@ 引用格式：江云鹤，程珂，赵晓波，欧阳亦聃. (2018). 水稻原生质体的分离及转化. Bio-101 e1010125. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010125. How to cite: Jiang, Y. H., Cheng, K., Zhao, X. B. and Ouyang, Y. D. (2018). Isolation and transformation of rice protoplasts. Bio- 101 e1010125. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010125. (in Chinese) 实验目的：亚细胞定位，BiFC 等需要进行瞬时表达的实验。 关键词：原生质体，黄化苗，酶解 材料与试剂 1. 2 ml 圆底离心管，10 ml 圆底离心管 2. 各种型号枪头 (所有与原生质体接触的枪头都要剪去尖头) 3. 刀片 4. 锡纸 5. 培养皿 6. 150 目的筛子 7. 中花11 黄化苗 注：将中花 11 种子按照组培方法于生根培养基中发芽，28 °C 暗培养 10- 15 天。 少于 10 天的黄化苗叶鞘很短，细胞太小，不利于观察；而大于 15 天的黄化苗叶鞘 由白色转为略带褐色，细胞太老，原生质体转化后活细胞很少。 8. 质粒 注：CsCl 梯度离心纯化的质粒，或者 QIAGEN plasmid Midi Kit (Catalog number: 12143)纯化的质粒 9. KOH 10. Cellulose RS (Yakult Honsha) Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010125 DOI:10.21769/BioProtoc.1010125 11. Macerozyme (Yakult Honsha) 12. PEG4000 (Fluka) 13. BSA (Sigma) 14. Mannitol (Sigma) 15. KCl (Sangon) 16. CaCl2 (BBI) 17. MgCl2 (Sigma) 18. NaCl (BBI) 19. MES hydrate (Sigma) 20. 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17) (见溶液配方) 21. 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55) (见溶液配方) 22. 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02) (见溶液配方) 23. 0.5 M MgCl2 (Sigma, FW: 95.21) (见溶液配方) 24. 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44) (见溶液配方) 25. 0.1 M MES KOH, pH 5.7 (见溶液配方) 26. MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) (见溶液配方) 27. 酶解液 (Enzyme solution) (见溶液配方) 28. W5 solution (见溶液配方) 29. MMG solution (见溶液配方) 30. 40% PEG 4000 (见溶液配方) 仪器设备 1. 真空泵 2. 摇床 3. 移液枪 4. 可调加减速度的吊篮式冷冻离心机 5. 计时器 6. Confocal 显微镜 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010125 DOI:10.21769/BioProtoc.1010125 实验步骤 1. 配制酶解液，现配现用(见溶液配方7)，同时准备0.6 M