林蛙抗菌肽软膏剂的制备及抑菌活性研究-吉林大学国家级生物试验.PPT

吉林大学国家级生物实验教学示范中心 National Model Laboratory of Biology Teaching 吉林大学国家级生物实验教学中心 * 林蛙抗菌肽的提取、分离纯化及其制剂的研究 * 中国林蛙主要分布在长白山区,是一种珍贵的两栖类药用和食用经济动物。近年来,随着林蛙人工养殖业的迅速发展,林蛙深加工的食品和保健食品的种类和数量发展迅速,极大的带动了我国林蛙产业的发展,尤其促进了东北三省食品加工业的发展和长白山自然资源的开发利用。林蛙产业的迅速发展和林蛙深加工产品市场的快速壮大表明,林蛙综合利用具有广阔的发展前景。 林蛙抗菌肽软膏剂的制备及抑菌活性研究 中国林蛙(Rana Chensinensis，David)，俗称田鸡、哈什蟆，主产于黑龙江、辽宁、吉林三省，尤以吉林省居多，主要分布在长白山区，是一种珍贵的两栖类药用、食用经济动物。 -*- 林蛙皮多肽 有效的抗生素：≥ 10 年 耐药菌的产生：≤ 2 年 来源：林蛙皮肤分泌 作用：抵抗外来致病微生物侵袭 性质：天然抗菌多肽 抗生素 抗生素替代物 抗菌肽的活性： 广谱抗菌（细菌、真菌等） 抗病毒(HIV)、抗肿瘤 作用广谱，作用靶点较多 直接在靶体细胞膜的水平上发生作用 皮肤感染疾病： 金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、部分肠菌 外用制剂类型： 凝胶剂、喷雾剂、软膏剂 等 研究意义 内容提要 1 3 制剂多肽含量测定、抑菌活性研究 林蛙抗菌肽提取、浓缩 2 林蛙抗菌肽软膏剂的制备 原料：中国林蛙蛙干 超声波提取 煮沸5min 离心，收集上清液 林蛙抗菌肽 1 林蛙抗菌肽提取研究 取一定质量的蛙干，以液料比（ml：g）15：1的比例加入6%的醋酸溶液，超声提取30min，双层过滤布过滤，滤液煮沸5min，离心，收集上清液，即为林蛙抗菌肽提取液。 超声波提取林蛙抗菌肽 林蛙抗菌肽制剂——软膏剂 林蛙干多肽提取液 30ml 石蜡 5g 液体石蜡 50g 白凡士林 5g 乳化剂OP 0.5g 对羟基苯甲酸乙酯 0.1g 单硬脂酸甘油脂 10g 终质量 100g 林蛙抗菌肽制剂——软膏剂 软膏剂制备工艺 取蛙干，加入15倍体积（ml：g）的6%醋酸超声提取30min，过滤，滤液煮沸5min，离心，得林蛙干多肽提取液，将油相（石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂OP、对羟基苯甲酸乙酯）与水相（林蛙干多肽）分别加热至80℃，将水相加入到油相中，边加边搅拌至冷凝，无菌条件下混合均匀，分装，即可。 LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，调节pH为7.0。 LB固体上层培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，调节LB固体上层培养基pH为7.0。琼脂加入量为1%。 LB固体下层培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，调节pH为7.0，琼脂加入量为2%。 每组(4人）配LB固体下层培养基100ml， 配LB固体上层培养基50ml 培养基的配置 林蛙抗菌肽制剂抑菌活性研究 林蛙抗菌肽制剂抑菌活性研究—滤纸片方法 （1）抑菌剂载体 5mm 直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h，保存备用 （2）实验方法 取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加抗菌肽提取液 5μL，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置恒温培养箱（37℃）中烤干备用。 （3）阴性对照样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加相同pH醋酸溶液5μL，干燥后备用。 （4）抑菌剂样片贴放：每人贴放1个染菌平板，每个平板贴放3片滤纸，分别为阴性对照样片一片，试验样片（1片为林蛙抗菌肽提取液，1片为0.1g软膏剂）。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm 以上， 与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置 37℃恒温培养箱，培养 16h 观察结果。用菌落分析仪测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。（移液器枪头） 林蛙抗菌肽制剂多肽含量测定 1、样品前处理 精密称取林蛙抗菌肽软膏剂，加入30倍体积的去离子水高速搅拌，8000r/min离心10min，收集水层，测定蛋白浓度。 2、试剂的配制 Folin甲试剂 A液：准确称取NaOH 10g，碳酸钠50g，加入400ml去离子水溶解，备用。