人HPPCn重组蛋白可溶性表达及其增殖活性检测.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（１２）：１５２０ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 人ＨＰＰＣｎ重组蛋白可溶性表达及其增殖活性检测 １ ２ ３ ３ ３ ２ １ ２ 路青山　乔媛媛 　李金凤 　王运良　王姗姗 　史成和 　杨霄鹏 　张达矜 （１郑州大学第二附属医院　郑州　４５００１４　２中国人民解放军海军总医院基础医学研究中心　北京　１０００４８） （３中国人民解放军第１４８医院　淄博　２５５３００） 摘要　ＨＰＰＣｎ是一种新的肝细胞刺激因子，获得较高纯度的具有生物活性的ＨＰＰＣｎ蛋白对研究 其生物学功能具有重要意义。ＨＰＰＣｎ在重组质粒ＰＥＴ２４ａ（＋）／ＨＰＰＣｎ中，诱导表达产物主要以 包涵体形式为主。为优化表达条件，运用冷休克表达载体ｐＣｏｌｄ 和无缝克隆技术获得重组质粒 Ⅱ ｐＣｏｌｄ ／ＨＰＰＣｎ，分别对诱导温度、时间、分子伴侣等诱导条件进行筛选，镍离子柱亲和层析纯化， Ⅱ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析目的蛋白特异性，不同浓度人ＨＰＰＣｎ重组蛋白（０、１０、１００ｎｇ／ｍｌ）刺激ＳＭＭＣ７７２１ 细胞，免疫细胞化学方法测定Ｂｒｄｕ掺入、ＰＣＮＡ表达变化。目的蛋白在培养温度为１６℃，终浓度 为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ过夜诱导时为可溶性表达，最终得到人重组ＨＰＰＣｎ蛋白纯度为９４．８８％， 人ＨＰＰＣｎ重组蛋白可刺激ＳＭＭＣ７７２１细胞Ｂｒｄｕ掺入增加、ＰＣＮＡ表达水平上调，其刺激作用具 有量效关系。通过冷休克表达系统获得可溶性表达的人重组 ＨＰＰＣｎ蛋白，其具有促进 ＳＭＭＣ７７２１细胞增殖的生物学功能，为深入研究ＨＰＰＣｎ的作用机制提供了技术条件。 关键词　ＨＰＰＣｎ　ＡＮＰ３２　冷休克表达系统　可溶性表达 中图分类号　Ｑ７８６ 　　哺乳动物肝脏在损伤后具有很强的再生能力，肝 更新的细胞以及部分肿瘤组织中表达水平较高，并参 脏再生是一个复杂的过程，许多基因和细胞因子（如 与小脑的形态学发育、细胞骨架动力学、细胞形态学、 ［３４］ ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ６、ＴＮＦ等）以不同的作用机制参与调 蛋白质降解以及细胞信号转导等多种生物学过程 。 α 节肝脏再生，但是这些细胞因子均缺乏特异性。１９７５ 　　为了研究ＨＰＰＣｎ的生物学功能，我们前期构建了 ［１］ ［５］ 年，ＬａＢｒｅｑｕｅ等 首次从肝脏中发现能特异性刺激肝 ＰＥＴ２４ａ（＋）／ＨＰＰＣｎ重组表达载体 ，但通过该系统 细胞增殖 的物质，即肝刺激物 （ｈｅｐａｔｉｃｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ 诱导表达的人ＨＰＰＣｎ重组蛋白以包涵体形式为主，因 ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ＨＳＳ），但是ＨＳＳ是一种蛋白混合物，其有效 目的蛋白纯化需要经过变性与复性等步骤，不仅操作 活性成份至今未得到完全阐明。ＨＰＰＣｎ（Ｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ 过程繁琐，而且可能影响到蛋白活性。为优化表达条 Ｃｎ）最早是从新生小牛肝脏ＨＳＳ中分离纯化的一种分 件，本研究采用了一种新的冷休克表达系统，通过无缝 子量为 ３０ｋＤａ、具有特异性肝刺激活性的蛋白质因 克隆（Ｓｅａｍｌｅｓｓ）技术将人ＨＰＰＣｎ基因插入原核表达载 ［２］ 体ｐＣｏｌｄ ，最终成功获得可溶性表达的人ＨＰＰＣｎ重组 子 。序列分析结果显示，ＨＰＰＣｎ与磷蛋 白 ３２ Ⅱ （ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ３２，ｐｐ３２）具有很高的