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实验方案:低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白
低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白
实验目的
利用低温乙醇法从人血清中分离出免疫球蛋白(Ig),并获得副产物血清白蛋白。
实验原理
(1)低温乙醇法Cohn6法:美国哈佛大学E·J·COHN教授研究组,在短短两年建立了低温乙醇分段提取法。
方法原理:往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂,如乙醇、丙酮等,主要是降低水分子的活度,降低溶液的介电常数,从蛋白分子周围排斥水分子,使蛋白分子之间通过极性基团的相互作用,在范德华力作用下,发生凝聚。不过由于有机溶剂存在,降低了蛋白分子表面憎水基团的作用,因而引起蛋白分子聚集的主要极性基团的相互电荷之间的引力。(文献20)
分离过程中,二法通过五个因素的变动(五变系统),使很多血浆蛋白质得以分离。这五个因素及其各自的作用是;①乙醇:使蛋白质分子“脱水”;⑦pH值;蛋白质在等电点时易于沉淀;②电解质浓度:在低离子浓度下,对蛋白质溶解度有较大影响;④蛋白质浓度:浓度越低,其沉淀作用越小;⑥温度:在低温下,可避免乙醇对蛋白质的变性作用。同时,蛋白质溶解为吸热反应,溶解度随温度上升而增高。
经实验得知,利用低温乙醇法能将血清蛋白分成六个组分(Ⅰ~Ⅵ),其中免疫球蛋白IgG主要存在于Ⅱ+Ⅲ中,白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。
(2) Cohn氏9法;该法对Cohn氏6法的组分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离和提纯,可获得组分Ⅱ—l,2,3(Y—G),组分Ⅲ一1(同种凝集素),组分Ⅲ—2(凝血酶原),组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。其工艺流程见图:
乙醇法生产中所用的乙醇是通过予冷、慢速搅拌滴入的。其体积可按下式计算:
式中V=所需乙醇体积;V0=原来溶液体积;C 1=原来溶液乙醇浓度;C2=所需达到乙醇浓度;C3=加入乙醇的浓度。
材料和试剂
3.1 血清:100 mL
3.2 相关试剂:95%乙醇,pH 4. 0醋酸盐缓冲液,磷酸盐缓冲液Ⅰ,磷酸盐缓冲液Ⅱ,3 mol/L NaCl溶液,1 mol/L NaHCO3 ,生理氯化钠溶液,麦芽糖,
3.3 实验仪器:
方法与步骤
基本思路:
血清的初处理——利用Cohn6法得到组分Ⅱ+Ⅲ——利用Cohn9法得到IgG——IgG沉淀的保存(浓缩蛋白液或冻干品)——Ig物理性状及生化检定(蛋白含量、纯度、免疫活性、稳定性)
4.1 血清的初处理(文献[4],名词.txt中关于血清的部分)
(1)将血清从冷冻箱(-5C至-20℃)取出后,先置于2-8℃冰箱使之溶解
(2)在室温下使之全溶。以上操作注意随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。
(3)热灭活(目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质,通常因为高温处理影响了血清的质量,故省略)。
4.2 低温乙醇法提取Ig及副产物Alb(生物制品基础摘录4~5,文献4、17)
(1)量取血清体积100 mL,搅拌降温至0~4℃,将血清调pH 7.2,调节NaCl浓度至0.14 mol/L,加乙醇至8%,加入乙醇的时间控制在60~90 min;从加乙醇开始起为反应体系降温,保持反应温度在-2~-4℃;加完乙醇后取样测pH值,调节pH值为7.2;继续搅拌1 h,静置30 min;3000 r/min离心10 min,去除上清,收集沉淀并称取质量。
(2)沉淀中加入0~4℃的注射用水,加水量为沉淀质量的7倍,持续搅拌直至成为均匀的蛋白浆;取样测pH值,蛋白浆中加磷酸盐缓冲液Ⅰ在-5℃,调pH 6.9~7.1,加0.05 mol/LNaCl,加乙醇至25%,从加乙醇开始起为反应体系降温,保持反应温度在-5℃;加完乙醇后取样测pH值,调节pH值为6.9~7.1;继续搅拌1 h,静置30 min;3000 r/min离心10 min,去除上清,收集沉淀并称取质量,沉淀即为免疫球蛋白。
(3) 将上述操作所得清夜在-5℃,调节pH至4.8,加乙醇至40%,加后反应30 min,搅拌1 h,进行离心,离心速度小于8000 r/min,取沉淀干燥,即为粗提取的副产物Alb。
4.3 Ig沉淀的保存
(1)蛋白液的浓缩方法
用0~4℃生理氯化钠溶液溶解沉淀,加量为沉淀质量的10倍,搅拌至完全溶解;取样测pH值,蛋白溶液中加入1 mol/L HCl,调节pH值为3. 60~4. 40。
将聚乙二醇(PEG, 即car—bowax4000W )用pH 值7.2~7.4、0.01 mol/L的PBS配成30%溶液,将装有蛋白液的透析袋浸入,在冰箱内浓缩5~12 h,一般可浓缩至原体积的1/3~1/20。用过的PEG在蒸发除去水分后可以重复利用。
(2)冷冻真空干燥
4.4 Ig物理性状及生化检定(文献22)
(1)蛋白含量的测定:紫外吸收法(生物制品基础摘录8,文献25)
将PEG 浓缩后的待测蛋白质溶液稀释10倍,使其光密度在0.2-2.0之间
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