免疫组化 protocol 方法与原理大全.docVIP

免疫组化有很多种方法，SP法是其中一种 免疫组化（SP法） 第一天 (5h) 准备：60℃ 烘片2-4h 二甲苯脱蜡1 30min 二甲苯脱蜡2 30min 100% 乙醇 10min 2次 95% 乙醇 3min 85% 乙醇 3min 75% 乙醇 3min ddH20 1min 2次 轻晃以防掉片 抗原修复： 使用1L烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M现配）溶液和41ml柠檬酸钠（0.1M）加450ml ddH20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min（可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min）之后自然冷却（30-40℃） 9ml柠檬酸配法：9ml ddH20加0.18g柠檬酸。可以直接称取0.18g柠檬酸加41ml柠檬酸钠加450ml水 0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g柠檬酸钠加入1L蒸馏水中，或14.7g加入500ml蒸馏水中 经过多聚甲醛固定的组织蛋白多肽会发生交联，导致部分抗原表位封闭，因此需要进行抗原修复。 抗原修复方法有以下几种： 1. 微波炉加热法。2. 热修复法（本实验采用）。3. 高压热修复法。4. 酶消化法 3%H202孵育10min（200ml，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H202至3%H202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP反应，造成假阳性），PBS冲洗3min 3次 HRP是辣根过氧化物酶，先与底物H202反应，再与DAB反应生成不溶于水及有机溶剂的棕色颗粒 加试剂A（山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min，用黄枪头抹匀试剂） 加一抗，4℃过夜，25-50ul每个组织，一抗用PBS稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖 第二天 (3h) PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里） 加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合） PBS 3min 3次 加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个 亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。因此试剂C与试剂B会结合） PBS 3min 3次，置于ddH20中 DAB避光显色，显色后置于ddH20中（准备一个小??杯，装有ddH20，DAB显色后在烧杯中洗下）DAB的配法：1. 关灯2. 取1号冰箱里的DAB?? 3. 取棕色EP管，12张片子约用1mlDAB，每张片子需3-4滴 4. 1ml DAB?加一滴DAB?（剧毒），配好后避光放置 苏木精 1min左右（苏木精伊红避光，苏木精配好后需要用纱布过滤） 流水冲洗2min 盐酸酒精分化2-3s（快速涮两下） 流水冲洗反蓝 20min 75% 乙醇 4min 85% 乙醇 4min 95% 乙醇 4min 100% 乙醇 4min 二甲苯1 10min 二甲苯2 10min 封片，鼠房抽屉里有中性树胶，长枪头沾取滴1-2滴（长盖玻片滴4滴）拿出片子，擦去背面多余的二甲苯，二甲苯易挥发，与中性树胶可溶，在组织旁滴上中性树胶后，立刻盖上准备好的盖玻片，放置通风处过夜晾干