pH区带逆流色谱技1课件.ppt

PH区带逆流色谱技术 (pH—zone—refiningCountereurrenct Chromatography);主要内容;发展与现状;高速逆流色谱（HSCCC) 双向逆流色谱（DuCCC） 正交轴逆流色谱 Ph区带逆流色谱;pH区带逆流色谱（pH-zone-refining counterrent chromatography）由Ito于1994年首次提出，利用待分离有机酸碱的酸!碱解离常数及疏水性的不同进行分离。与普通逆流色谱相比其突出特点是在溶剂体系的固定相中加入保留酸（或碱）同时在流动相中加入洗脱碱（或酸）不同物质洗脱出来时伴随着ph 值的突变。该技术可以得到最小重叠的矩形峰同时杂质被集中在峰的两侧具有样品分离容量大。分离纯度和分离效率高等优点。;;保留碱 或酸 的作用是在溶质区前面将溶质从流动相转移到固定相中 洗脱酸 或碱 的作用是在溶质区后面将溶质从固定相转移到流动相中 当存在多种较大量的溶质时 具有最大= pka 值和亲水性的溶质首先流出柱子 依此类推 并以不同溶质区ph 值 的 降 低( 或 升 高 )为 标 志 达 到 分 离 目 的(见图2);影响分离效果的因素;;逆流色谱转速 ;编号 1 至 3 依次表示转速为 400r/min、600r/min、800r/min, 4表示转速前 600r/min，然后调速至 800r/min的情况。 由图 3 可知，转速越大，保留值越高，分离效果 越好。但是情况 3和情况4 的保留值比较接近，所 以在通常的实验中普遍采用的都是情况 4， 这样既 能保证固定相保留值，也能使仪器不必要长时间在 800r/min 以上高速运转，同时也避免了由于高速旋 转造成的乳化。;溶剂组成;根据色谱分辨率的计算公式：计算上述a、b、c图的分辨率依次为 0.9814， 1.4150 和 2.0120 溶剂系统中水的体积含量始终占 50%， 正丁醇的含量代表了系统的极性， 含量高， 极性大， 含量低， 极性小,分辨率与正丁醇含量 （极性） 的关系如图 所示;进样量;酸碱浓度;应用; pH区带逆流色谱(pH—zone—refining CCC)的洗脱色谱图形与顶色谱和等速电泳相似，主要组分的峰组成一系列矩形色谱峰，各色峰之间很少重叠，一般针对可离子化的分子如羧酸、胺等。操作时选择两相体系如甲基叔丁基醚：水，平衡后取上层溶剂加入适量的作为“保留剂”的酸如三氟乙酸并作为固定相，下层溶剂加入适量的作为“取代剂”的碱如氨水并作为流动相。以分离有机酸R1COOH、R2COOH、R3COOH(pKa1pKa2pKa3)为例(图3)，首先将酸化的固定相注人色谱柱中，然后加入用固定相溶解的样品。泵人流动相后，在色谱柱足够长的情况下整个体系达到“等速”状态，与氨水界面移动的速度同步。酸性较强的R1C00H先与氨水作用，转化为 R1COO一和NH4+产生，但R1COO一随即被酸性更强的CF3COOH质子化，又变为R1COOH回到固定相， CF3COO一和NH4+先洗脱出。同样，CF3COOH消耗完变为CF3COO一后，R1COOH提供质子，使R2COO一转化为R2COOH留在固定相，直至所有的R1COOH转变为R1COO一，并随流动相洗脱出，形成R1COO一的矩形色谱峰。与此类; 推，其次洗脱出的是R2COO一矩形峰，最后是R3COO一的矩形峰。由在所有的R1COOH转变为R-COO一前，R2COO一不会洗出，因此，R1COO一在色谱图上形成矩形峰，与R2COO一很少重叠， R2COO一和R3COO一的峰也是如此。 二硝基苯亮氨酸(DNP—Leu)、丙氨酸(DNP—AIa)和天冬氨酸(DNP—Asp)的pKa值分别为2．33、2．35和1．99、3．90(pCOOH)，以MtBE-H20平衡后的上相为固定相并加入适量三氟乙酸，下相为流动相并加入适量的氨水，它们pH区带逆流色谱行为如图3所示，得到很好的分离效果(图4)。;;同样，若被分离的样品是碱类如生物碱等，也可以碱为保留剂，酸为取代剂，进行pH区带逆流色谱分离。此外，也可以选择下相溶剂为固定相，上相溶剂为 流动相，因此，pH区带逆流色谱扩大了逆流色谱的应用范围，提高了样品的进样量，可进行制备性的样品分离，在氨基酸及其衍生物、多肽、氧杂葱染料、生物碱、多酚和异黄酮类等化合物的分离方面得到应用。如用正丁醇：0．03tool三氟乙酸(1：1)分离了粘菌素；用正丁醇：0．2tool甲酰氨分离了缩胆囊素。pH区带逆流色谱也可以用于有机酸对映体的分离，1一甲基一4一甲氧甲基环己基甲酸的两个异构体由于立体位阻效应不同使酸性产生差异(图5)，从而得到分离。;近来ph区带逆流色谱技术又有新的改进 例如 除保留酸外还加入乙酸 丙酸 丁