凝胶柱色谱分离蛋白质幻灯片.pptVIP

凝胶柱色谱分离蛋白质 【目的要求】 1、熟悉凝胶色谱分离的基本原理； 2、掌握凝胶柱色谱填充物的装柱、平衡、加样、洗脱等基本操作技术。 【实验原理】 凝胶色谱是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的技术。当溶液在色谱柱内流过时，各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，难于进入凝胶颗粒的微孔，只能在凝胶颗粒的间隙中随流动相快速向下移动；而小分子物质能够扩散进入凝胶颗粒的微孔中，因此在流动过程中不断地进出于胶粒的微孔，这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质，从而使溶液中的各组分按分子量从大到小的顺序先后流出色谱柱，达到分离纯化的目的。 【实验用品】 1、材料 葡聚糖凝胶Sephadex G-100、蓝色葡聚糖2000、溶菌酶 2、试剂 （1）蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）和溶菌酶（6mg/mL）组成的混合液 （2）0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液 3、器具 色谱柱、铁架台、试管、紫外分光光度计或紫外检测仪、电炉、容量瓶、烧杯、三角瓶、滴管、移液管、玻棒。 【实验过程】 凝胶溶胀：根据预计的总床体积和所用干胶的床体积，称出所需干凝胶放入大三角瓶或烧杯中，加入过量的缓冲溶液或去离子水，浸泡24h以上或沸水浴中煮沸溶胀2~3h，冷却至室温。用倾泻法将不易