原生质体的培养与体细胞杂交课件.ppt

第九章 原生质体培养和体细胞杂交;本章大纲;; 什么是植物原生质体？;原生质体;;9.1.1.2 材料的预处理;(3)预萎蔫 将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片稍萎蔫，则有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁分离原生质体。 (4)预质壁分离 把材料先放到与酶溶液中糖浓度相同的糖溶液中预培养1h左右，是细胞质壁分离，然后再放入酶液去壁。 加快原生质体的释放，提高原生质体的活力。 ;9.1.1.3 分离方法;⑴ 常用酶的种类;⑵ 酶液的配制;常用的渗透稳定剂;稳定剂中附加钙盐（0.1%）可以增强质膜稳定性 葡聚糖硫酸钾（0.5%-1%）能抑制酶液内某些杂酶和RNA酶的活性，也有助于质膜稳定 加入少量AgNO3能减少酶解时产生的乙烯 加入过氧化氢歧化酶以减轻O2ˉ自由基对细胞膜的损伤，从而提高原生质体的植板率;（3）分离原生质体;直接法;分离需注意：;9.1.2.1 原生质体的纯化;（1）离心沉淀???（沉降法） ;（2）漂浮法 滤液 原生质体漂浮于溶液表面，杂 质下沉到管底 反复 离心和重新悬浮2-3次，最后用原生质体培 养基洗涤1次后调整到所需密度进行培 养。;原理：高分子聚合物混合液产生两相水溶液，通过离心可使原生质体处于两液相的界面之间 优点：可获得数量较大的纯净原生质体，同时避免了在收集过程中原生质体因相互挤压而破碎;9.1.2.2 原生质体活力的测定;（2）活力染色;FDA法： 双醋酸荧光素（fluorescein diacetate,FDA）无荧光、无极性，可自由透过原生质体膜进入内部，进入后由于受到原生质体内酯酶的分解而产生有荧光的极性物质荧光素，它不能自由进入质膜。在荧光显微镜下观察到产生荧光的是有活力的原生质体，相反，不产生荧光的是无活力的死原生质体。;9.2 原生质体培养;（1）无机盐： 钙离子浓度和氮源的种类及其浓度对原生质体培养效果影响最大 钙离子：影响原生质体膜的稳定性，一般较高浓度的钙离子对原生质体的分裂有利 氮源：高浓度的铵根离子对原生质体有毒害作用，一般应将培养基中的铵离子浓度大幅度降低，用有机氮代替铵态氮 ;(2)渗透稳定剂;（3）有机成分;Ammonium Nitrate 600.0 mg/L （硝酸铵） Boric Acid 3.0 mg/L （硼酸） Calcium Chloride, Anhydrous 453.0 mg/L （无水氯化钙） Cobalt Chloride 6H2O 0.025 mg/L （酮类衍生物） Cupric Sulfate 7H2O 0.025 mg/L（七水硫酸铜） Na2 EDTA 37.25 mg/L Ferrous Sulfate 7H2O 27.85 mg/L （硫酸亚铁） Magnesium Sulfate 146.55 mg/L （硫酸镁） Manganese Sulfate H2O 10.0 mg/L （硫酸锰） Molybdic Acid, Sodium Salt H2O 0.25 mg/L Potassium Chloride 300.0 mg/L（氯化钾） Potassium Iodide 0.75 mg/L （碘化钾） Potassium Nitrate 1900.0 mg/L（硝酸钾） Potassium Phosphate, Monobasic 170.0mg/L（磷酸钾） ;（4）植物生长物质;9.2.2 培养方法;9.2.2.1 液体培养;（2）微滴培养（microdroplet culture）;9.2.2.2 固体培养-琼脂糖包埋;9.2.2.3 液体-固体结合培养;（2）琼脂糖珠培养;9.2.2.4 饲喂层培养;9.2.3 原生质体的再生培养;原生质体的分离、培养和植株再生过程;1.细胞壁再生;原生质体初生细胞壁的成分与供体材料不同 主要成分：非纤维素多糖（60%） 纤维素（5%） ;2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成;原生质体植板率因其供体植物不同而有很大差异，从0.1%-80%不等;;3、植株再生;油菜原生质体培养与植株再生;a 易碎的胚性愈伤组织 b 悬浮细胞聚合 c 新鲜原生质体 悬浮培养 d FDA法测活力 e 原生质体细胞分裂 g 琼脂糖包埋 h 绿芽形成;;;9.3 体细胞杂交;;9.3.1 原生质体的选择;4、在异核体发育中有能选择杂种的标记性状 5、若是以育种为目的，两亲本的亲缘关系或系统发育关系不应过远 6、根据需要，可以选择含有部分遗传信息或部分染色体的一个