基因测序的前世今生(一代测序,二代测序,三代测序最详原理).pdfVIP

测序技术的前世今生 测序技术的发展历程 第一代测序技术 （Sanger 测序） 第一代DNA 测序技术用的是1975 年由桑格（Sanger ）和考尔森（Coulson ）开创的链终止法 或者是1976-1977 年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert ）发明的化学法（链降解）,在 2001 年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger 法为其测序基础。 原理：ddNTP 的3’无羟基，其在DNA 的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中 断DNA 合成反应，在4 个DNA 合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP 和ddTTP ），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置 确定待测分子的DNA 序列。 第二代测序技术(NGS) 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999% ，但其测序成本 高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以 Roche 公司的454 技术、illumina 公司的Solexa 、Hiseq 技术和ABI 公司的Solid 技术为标记的第二 代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确 性，以前完成一个人类基因组的测序需要3 年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1 周，但在 序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。 1. illumina Illumina 公司的Solexa 和Hiseq 是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75% 以上， 以HiSeq 系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4 步： 1）构建DNA 测序文库 DNA 分子用超声波打断成200bp-500bp 长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。 2 ）测序流动槽（flowcell ） 结构：Flowcell 是测序的载体，课吸附DNA 文库，每个flowcell 有8 条lane，每个lane 有2 行column，每行column 有60 个tail ，每个tail 经CCD 镜头课捕获荧光信号。 3 ）成簇（cluster ） NGS 的核心技术特点，目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到CCD 镜头摄 取荧光的信号要求。大体原理网上都可查到，在此解答2 大难理解之处： 一．可逆终止荧光dNTP(Illumina 测序核心技术) 荧光修饰dNTP 可逆合成终止（包括用叠氮基团即起到了可逆终止作用和用不同荧光集团区 别碱基信号的功能），是Illumina 测序的最核心技术。 1. 上图是修饰过的dCTP 分子结构式，在核苷酸糖基的3位连一个叠氮基团（红色基团）。这个 叠氮基团在链延伸的时侯起到了阻止聚合的作用 （理解见下图DNA 复制时的5’和3’的示意图， 下一个碱基合上时是：下一个核苷酸的5’P 连接到上一个核苷酸的3’OH ，故如果下一个核苷酸的 3’带有叠氮基团而非自然状态下的OH 时，下一个核苷酸就无法合上。） 。 2. 叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂（例如：二巯基丙醇），叠氮基团会发生断裂， 并在原来的位置留下一个羟基因此在荧光照相之后可以借此回复3’的-OH 状态，以供下一个碱基 合上。 3. 在碱基上，通过连接臂（蓝色基团）连接一个荧光基团。4 种dNTP 分别连4 种不同颜色 的荧光基团。测序时，通过识别荧光基团的颜色，就可以判断原来的碱基是哪一种。在dNTP 被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP 和DNA 聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入 激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利 用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。荧光信号记录完成后，再加入化学试剂[TCEP(Tris (2-carboxyethyl) phosphine,三(2-羧乙基)膦)]淬灭荧光信号,并用巯基试剂去除3位阻断的叠氮基 团，以便能进行下一轮的测序反应。 注：每一步试剂具有极高的处理效率，因为在要重复几百次的反应中 （30~40x 测序），每 步的得率差一点，最终的结果就会差许多，所谓的指数放大效应。 缺点