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OutlineReal Time PCR and Conventional PCRIntroduction to Quantitative PCRCt value and Real-Time Quantitative PCR TheoryLaboratory TechniquePrimer Design for Real-Time PCRReal Time PCR and Conventional PCR技术背景本来，PCR技术是为了将样本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性随着研究的深入，需要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，这就要了解标本中的DNA原始拷贝数。5’3’5’3’5’3’5’3’Taq5’3’5’5’5’3’Taq常规 PCR ProcessDenaturationPrimer AnnealingElongationRepeatIn theory, product accumulation is proportional to 2n, where n is the number of amplification cycle repeatsTheoreticalReal LifeLog Target DNAReality vs. TheoryAmplification is exponential, but the exponential increase is limited:A linear increase follows exponentialEventually plateausCycle #常规PCR方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差＞1000%）；存在扩增产物的污染问题。必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒无法对扩增反应实时检测CyclePCR: Theory vs. Reality C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.End PointReal-Time PCR 实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的未知样品 的起始浓度进行定量的方法。 Quantitative PCR /Real time PCR Quantitative PCR 或 Real time PCR 是确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法CyclePCR: Theory vs Reality C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.End PointC(t)定量的最佳时期TheoreticalQuantitative information comes from monitoring the early stages of amplification.DetectorLog Target DNAReal LifeCycle #常用的定量方法相对定量：相对于另一参照样本的量；绝对定量：用标准品作标准曲线来推算未知的样本的量。Quantitative PCR和常规PCR技术的区别常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）；Quantitative PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法（准确定量） 。Introduction to Quantitative PCRPCR仪 + 监测、分析系统 + 荧光标记 定量PCR仪应该具备的特点：杰出的温度控制采用半导体加热和制冷加热速度 3.3°C /秒 ，制冷速度 2°C/秒升降温速度可调控温准确性：±0.3℃定量PCR仪应该具备的特点：梯度PCR功能采用多点温控和传感技术，可以实现梯度PCR功能温度梯度选择可以允许使用者在同一次扩增中优化复性温度。定量PCR仪应该具备的特点：消耗品成本低，样品容量大同时扩增和检测96个样品采用0.2ml的离心管, 排管和 96孔PCR反应板。 降低消耗品成本。Introduction to Quantitative PCRPCR仪 + 监测、分析系统 + 荧光标记 定量PCR仪应该具备的特点： 先进的光路设计----多孔样品同时检测EmissionFilterDetectorExcita