普通PCR及测序PCR原理.pptVIP

一 PCR技术 什么是PCR? 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。 PCR反应的几个要素 DNA聚合酶 生产机器 模板（要扩增的DNA） 引物 dNTPs 原料 Buffer（缓冲液） 稳定的环境 Mg 2+ 等 润滑剂 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 （6）两引物间避免有互补序列。 （7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限制。 （6）缓冲液（Buffer） 10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温） 50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性 0.01% 明胶 保护酶不变性失活 一个典型PCR体系 反应体系（50 ul）： Taq酶 2.5 U 10x Buffer 5 ul dNTP(2.5mM) 4 ul DNA模板 0.1～2ug 上游引物(10P) 2 ul 下游引物(10P) 2 ul H2O 补足至50 ul 总计 50 ul 反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）： 95℃ 5 min 95℃ 30 s 55℃ 30 s 72℃ 1 min 72℃ 5 min 4 ℃ ------ PCR常见问题 假阴性，无扩增产物 无扩增产物 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 PCR的不同类型 重组PCR 不对称PCR 反向PCR 多重PCR 原位PCR 连接酶链反应 巢式PCR 递减PCR 热启动PCR RT－PCR 实时定量PCR LCR连接酶链反应 LCR （Ligase chain reaction）基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增. 若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物. 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR （HotStart PCR） 逆转录反应的一般步骤 RNA模板+反转录引物，70℃，5min, 冰浴1min。 再加以下反应组分： Buffer dNTP 逆转录酶抑制剂 逆转录酶 以上组分加好后，混匀，42℃或37℃ 60min。 70℃，5min 后再冰浴，所得产物就是cDNA， cDNA用做后面的PCR的模板。 二 、测序原理 双脱氧核苷酸终止测序法（也叫sanger测序法）的原理是：在PCR体系中加入双脱氧核苷酸（ddNTP）， 在PCR延伸过程中ddNTP随机掺入到合成链中从而导致延伸的终止，经过大量的这样随机终止的PCR反应，生成一系列长度相差1个碱基的PCR产物混合物，此产物通过电泳根据不同长度片段的电泳速度不同来检测整段DNA的序列。 双脱氧终止法示意 双脱氧终止法示意 双脱氧终止法示意 双脱氧终止法—示意 双脱氧终止法测