接踵经过冷冻保存的菌株.PDF

菌的生長與培養 接踵經過冷凍保存的菌株 抽取大量質體之10 ml液態培養 辛苦的養菌，Plasmid產量也要滿意才可以! 您的養菌方法正確嗎? 小細節都注意到了，可以讓您實驗更順利哦 !  凍菌經低溫長期保存後，我有先沾取並塗抹於含有抗生素之 LB agar培養盤，再挑選單一菌 落做接踵。  我所挑選的單一菌落，是新鮮塗盤後生長出的菌落，並非取自已經於4 ℃保存多日之培養盤。  我使用LB培養液養菌時，所選擇的器皿與 我預培養的菌液量，體積比例為 5:1 ，如此便能夠 提供菌足夠的換氧空間。  我知道菌液以LB培養液培養於37℃ ，所謂的overnight培養，是指 16~18小時，因為18小 時培養液中的養分殆盡，菌開始將 plasmid丟棄也漸漸死亡，而這樣會影響到我純化plasmid 的效果。  如果需要培養大量的菌液，我會使用已經培養 ~8小時的pre-culture ，將其稀釋1/500到 1/1000後再大量培養，而不是取單一顆菌落直接接踵。  我在開始準備進行純化plasmid之前，都會先測量菌的濃度。當E.coli的 OD600=1時，菌量約 8 為5~8* 10 。 培養純化質體DNA菌的流程圖 以Glycerol凍存的stock菌株 經塗盤到含有抗生素之 LB agar plate上 從培養皿中挑選單一菌落 接踵到liquid LB中的 pre-culture (~8 hr) 接踵到liquid LB中的 liquid culture (16~18 hr) Plasmid DNA純化之樣品前處理 接踵經過冷凍保存的菌株  菌株可置於 -70℃做長期的保存。在經過長期的保存之後，再將菌株取出重新培養，需要讓菌 可以回復到正常生長的狀態，因此，為了讓菌回復並開始複製質體 DNA ，在培養時應避免直 接將凍菌以牙籤或是吸管尖取出直接接踵到LB培養液中。 1.準備好已加入適當抗生素的LB agar培養盤，將凍存的菌株沾取適量塗盤後在37 ℃培養 overnight 。 2.挑取單一菌落並接踵到10 ml含有適當抗生素的 LB培養液中，在37 ℃搖晃培養overnight 。 一般會建議先塗盤培養再取所生長出之單一菌落進行液態培養是因為，如此可以確認細菌細 胞中所帶有的plasmid仍然存在，並沒有因為凍存後產生突變。另外也可以確保接下來培養 的菌都擁有相同的基因組，都是從同一個母菌株再分裂出來的。 抽取大量質體之10 ml液態培養  培養用於大量Plasmid純化的菌時，並非培養液給得越多菌就可以長越多。在一般正常成的 情況之下，菌培養到4~5小時才會進入正常生長期，在這之前菌都還在適應新的環境，而在 培養 16~18小時會進入生長的平原期; 此時的菌會因為培養液中的養分漸漸耗盡，開始走向死 亡。因此，若需要讓菌大量的生長，操作者除了給予充分的培養液之外，也必須選擇正在壯 年期的菌來去做培養。  依照所使用的純化套組可抽取之樣本體積 (GeneMark Plasmid Midiprep Purification Kit/20~100 ml; Plasmid Maxiprep Purification Kit/100~400 ml)來做培養，必須先將 從新鮮塗盤後長出的單一菌落，經挑選後接踵於 ~5ml含有抗生素之 LB培養液，於37℃搖晃 培養8小時之後，此時稱之為pre-culture 。將pre-culture稀釋 1/500~1/1000倍後再加入 所需的培養液量。 e.g. 1 L的 medium加入10 ml的 pre-culture  將LB培養液置於37℃搖晃培養overnight之後就會是成長健康的菌，可以接續純化plasmid DNA 。