豆制品中碱性橙2的测定BJS201715.DOC

—— PAGE \* MERGEFORMAT6 — — PAGE \* MERGEFORMAT5 —— 附件3 豆制品中碱性橙2的测定 BJS 201715 1 范围 本方法规定了豆制品中碱性橙2的高效液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本方法适用于豆腐、豆干、腐竹、豆皮、油炸豆腐中碱性橙2的测定和确证。 2 原理 试样经水-乙酸-乙酸铵-乙腈超声萃取，提取液于-20 oC冷冻分层，离心去除少量脂质类杂质，酸化后以混合型阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱测定和确证，外标法定量。 3 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 乙腈（CH3CN) ：色谱纯。 3.1.2 甲醇（CH3OH) ：色谱纯。 3.1.3 甲酸（HCOOH) ：色谱纯。 3.1.4 甲酸铵（HCOONH4) ：色谱纯。 3.1.5 氯化钠（NaCl）：分析纯。 3.1.6 冰乙酸（CH3COOH）：分析纯。 3.1.7 乙酸铵(CH3COONH4)：分析纯。 3.1.8 0.4 %乙酸-20 mmol/L乙酸铵水溶液：精确称取乙酸铵0.77 g，移取冰乙酸2 mL，用水溶解并定容至500 mL。 3.1.9 0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸铵水溶液：精确称取甲酸铵0.32 g，移取甲酸0.5 mL，用水溶解并定容至500 mL。 3.2 标准品 碱性橙2：中文别名王金黄，英文名称Chrysoidine，CAS号:532-82-1，分子式C12H12N4·HCl，分子量248.72，纯度≥95%。 3.3 标准溶液配制 3.3.1 标准储备液：准确称取适量碱性橙2标准品，用少量50%乙腈水溶解，再用乙腈定容，制成1000 mg/L标准储备液，-18℃以下保存，标准储备液在12个月内稳定。 3.3.2 空白基质溶液：按照6.1规定的样品预处理方法操作制备。 3.3.3 标准系列工作液：用空白基质溶液（3.3.2）将标准储备液（3.3.1）稀释成0.5 μg/L 、1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、15.0 μg/L作为液相-质谱/质谱标准工作液。现配现用。 3.4 材料 3.4.1 Oasis MCX固相萃取小柱：60 mg/3 mL，或性能相当者。使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水进行活化。 3.4.2 聚四氟乙烯滤膜：0.22 μm。 3.4.3 具塞塑料离心管：50 mL、 15 mL。 4 仪器和设备 4.1 超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 4.2 电子天平：感量为0.000 1 g和0.01 g。 4.3 漩涡混合器。 4.4 超声波清洗器。 4.5 低温离心机：转速不低于5000 r/min。 4.6 组织捣碎机。 5 试样制备与保存 将固体样品充分粉碎混匀，试样于?-18℃以下冷冻保存。 6 分析步骤 6.1 样品预处理 6.1.1 提取 称取1 g（精确到0.01 g）干燥试样或2g含水试样于50 mL塑料离心管内，加入2.5 mL0.4 %乙酸-20 mmol/L乙酸铵水溶液（3.1.8）混匀、加入10 mL乙腈，涡旋混匀15 s，超声萃取30 min，静置分层，4oC下9000 r/min离心10 min，取上清液于50 mL离心管内。残渣中再按上述步骤复提取一次，合并上清液。 6.1.2 净化 6.1.2.1 -20°C冷冻、离心 提取液中加入约0.5 g 氯化钠，于-20oC冷冻2 h，分层，取出后4oC下9000 r/min离心5 min，上层乙腈待过固相萃取柱净化或直接用于LC-MS/MS测定。 6.1.2.2 过固相萃取柱 取乙腈提取液（6.1.2.1）10 mL，加入200 μL甲酸酸化，过Oasis MCX固相萃取小柱（3.4.1），用5mL甲醇淋洗，然后将固相萃取柱抽干，用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱目标化合物，收集洗脱液，35℃氮吹浓缩至近干，用2.0 mL 80%乙腈-水溶液溶解，9000 r/min离心5 min或过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜，LC-MS/MS测定。 6.2 液相色谱-质谱/质谱仪器测定参考条件 6.2.1 超高效液相色谱条件 a) 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm × 100 mm，或性能相当者； b) 流动相：A为0.1%甲酸-10mmol甲酸铵水溶液（3.1.9），B为乙腈（3.1.1），梯度洗脱条件见表1； c) 流速：0.3 mL/min； d) 柱温：40°C； e) 进样量：5 μL。 表1 超高效液相色谱梯度洗脱条件