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PART 传统的DNA测序方法 演讲人：马怡 2016.3.31 传统的DNA测序法 1 Sanger双脱氧链终止法 2 Maxam-Gilbert化学降解法测序 Sanger双脱氧链终止法 英国生物化学家Frederick Sanger，于2013年11月19日逝世，享年95岁。 他是唯一一个两度斩获诺贝尔化学奖的科学家，也是仅有三位得到两次科学类诺贝尔奖的人之一。 他的第一个诺奖是1958年，开发了蛋白质化学结构的测量方法、并测定了胰岛素的氨基酸序列。第二个诺奖是1980年，发明了测定DNA序列的双脱氧链终止法。人类基因组计划用到了这一方法，因此他常被称为基因组学之父。不知道他终止在哪一个碱基上。 科学作者 Ed Yong 用DNA序列写了一段悼词： “CGCATTCCGTTTCGCGAAGATAGCGCGAACGGCGAACGC” Sanger双脱氧链终止法 Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 1 Maxam-Gilbert化学法测序 基本原理是，首先对待测DNA末端进行放射性标记，再通过4相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，其中每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。因此，产生4组不同长度的放射性标记的DNA片段，每组中的每个片段都有放射性标记的共同起点，但长度取决于该组反应针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。此后各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影检测末端标记的分子，并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。 1 待测DNA的末端标记 化学降解法测序首先要制备单侧末端标记的待测DNA片段。 01 碱基特异的化学切割反应 肼(hydrazine)：C和C+T 二硫酸甲酯：G 02 测序图谱的识读 如果在G+A泳道中出现一条带，就看G泳道中是否有相同大小的带，如果有即为G碱基，如果没有则为A碱基；同样，在C+T泳道中出现的条带，就检查C泳道中有无同样大小的条带，如果有即为C，无则为T。 03 THANKS! PART