微小隐孢子虫黏蛋白CGD5_2060原核表达及其黏附功能.PDF

浙江大学学报（农业与生命科学版） 44（2）：230～236，2018 JournalofZhejiangUniversity(Agric.&LifeSci.) /agr E-mail:zdxbnsb@ DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2018.03.123 微小隐孢子虫黏蛋白CGD5_2060原核表达及其黏附功能 阳毅敏，潘灵韬，庄浩瀚，孙洪超，杨怡，陈学秋，杜爱芳*1 （浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所，杭州310058） 摘要 从微小隐孢子虫cDNA 中克隆黏蛋白cgd5_2060 基因，并对其蛋白功能相关基序进行预测；构建原核表达载体 pET32a-cgd5_2060 ，转化至大肠埃希菌Rosetta 中，诱导表达并纯化重组蛋白CGD5_2060 ，制备鼠源多克隆抗体，并通 过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA) 方法测定其抗体效价；将纯化的重组蛋白 CGD5_2060 及载体对照蛋白与Caco2 细胞共孵育，通过蛋白质印迹法（Western blotting ）与间接ELISA 方法检测其细 胞黏附特性。结果表明，CGD5_2060 蛋白的1～19个氨基酸为信号肽，说明该蛋白是分泌型蛋白。使用PROSITE 数 据库分析发现：该蛋白含有1个富含苏氨酸的区域TTTTTTKSTTTTTTAVTT ，位于510～527 个氨基酸处；此外，还有 1个与细胞黏附有关的序列RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸），位于69～71 个氨基酸处。上述结果表明，cgd5_2060 基 因可能与微小隐孢子虫黏附宿主细胞相关。原核表达的重组蛋白CGD5_2060 具有良好的免疫原性，获得了较高效价 的多克隆抗体。重组蛋白与Caco2 细胞共孵育，通过蛋白质印迹法与间接ELISA 方法检测发现，CGD5_2060 可以与 Caco2 细胞黏附。本试验为揭示微小隐孢子虫黏附细胞的机制提供了一定的理论基础。 关键词 微小隐孢子虫；黏蛋白基因cgd5_2060 ；原核表达；细胞黏附 中图分类号 S 855.9 文献标志码 A Prokaryotic expression of Cryptosporidium parvum mucin CGD5_2060 and its role in adhesion. Journal of Zhejiang University (Agric. & Life Sci.) , 2018,44(2):230-236 YANG Yimin, PAN Lingtao, ZHUANG Haohan, SUN Hongchao, YANG Yi, CHEN Xueqiu, DU Aifang* (Institute of Preventive Veterinary Medicine, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) Abstract The gene cgd5_2060 was cloned from Cryptosporidium parvum cDNA, and its function-related motifs were predicted. The prokaryotic expression vector pET32a-cgd5_2060 was constructed and transformed into Escherichia coli Rosetta. The recombinant protein CGD5_2060 was expressed and purified, with which the murine polyclonal antibody was prepared, and its antibody titers were determined by indirect enzyme-li