白术和苍术及其混伪品DNA条形码鉴定研究.docVIP

白术和苍术及其混伪品DNA条形码鉴定研究 　　[摘要]药材白术与苍术为苍术属植物，为常用健脾之要药，但二者功效不完全相同，古代对二者未进行区分，现代用药也容易将其混用，为了确保用药安全，该文采用ITS2序列对药材白术与苍术及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究。白术与苍术的3个基原物种（苍术、关苍术和朝鲜苍术）ITS2序列均为229 bp。13条白术的序列仅在98 bp处有C-G变异，平均GC含量为69.42%；4条苍术序列无变异位点；关苍术与朝鲜苍术的种内最大K2P距离均为0.013。白术、苍术、关苍术和朝鲜苍术种内最大K2P距离均小于与混伪品的种间最小K2P距离。邻接（NJ）法构建的系统聚类树，白术、朝鲜苍术序列能各自聚为一支，关苍术与苍术聚为一支，但都能与混伪品明显分开。ITS2序列在药材白术与苍术及其混伪品的鉴定方面具有很好的鉴别效果。 　　[关键词]白术；苍术；混伪品；DNA条形码 　　白术与苍术均为常用大宗类药材，均能健脾、燥湿，治疗脾失健运、湿浊中阻[1]。但白术偏重于补气健脾，宜于脾虚湿阻者；苍术苦温燥湿力强，宜于寒湿阻滞中焦而脾虚不明显者。由于二者同为菊科苍术属Atractylodes DC.植物，功效及在名称上的相似，造成苍白二术容易混用。《中国药典》2010年版规定白术来源为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；苍术的来源为菊科植物茅苍术A. lancea （Thunb.） DC.或北苍术A. chinensis （DC.） Koidz.。北苍术作为一个混杂的商品概念包括了关苍术A. japonica Koidz. ex Kitam.和朝鲜苍术A. coreana （Nakai） Kitam.[2]。 　　目前市场上二者常见的混伪品包括菊三七Gynura japonica （Thunb.） Juel.、土木香Inula helenium L.、云木香Saussurea costus （Falc.） Lipech.以及毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的根茎[3-4]。由于药材形态特征有限，难以从外观上进行快速准确的鉴定，容易造成混用，影响用药安全。 　　DNA条形码鉴定技术因其通用、快捷等优势一经提出便得到了广泛的关注[5-8]，尤其对于缺失遗传背景信息的中药材样品具有较好的鉴定能力[9]。Chen等对753个属4 800种植物超过6 600条ITS2序列进行分析，发现ITS2序列在种级水平上具有较高的分辨率[10-11]，在蔷薇科、卷柏科的药用植物鉴定中得到了很好的验证[12-13]。国家药典委员会也讨论通过了在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[14]。DNA条形码鉴定技术已经在药材冬虫夏草、枸杞、羌活、党参等[15-20]药材及其混伪品的鉴定中取得了良好的效果，在植物的检验检疫、药材市场监督以及法医鉴定等诸多方面也得到了很好的应用[21-22]。本研究对白术与苍术及其主要混伪品进行DNA条形码的鉴定研究，确保白术与苍术的用药安全。 　　1 材料 　　本文收集了白术、苍术、关苍术、朝鲜苍术及5种混伪品的基原植物及药材共51份样本（表1）。所有样本均经过中国医学科学院药用植物研究所林余霖教授鉴定。因其根茎不发达而不作药用的同属植物鄂西苍术A. carlinoides （Hand.-Mazz.） Kitam.的3条ITS2序列来源于Genbank。 　　2 方法 　　取药材样本约50 mg，去除表皮取其中间部分，用高通量组织球磨仪50 Hz频率研磨2 min后，核分离液洗涤3次（800 μL/次），去上清液，留沉淀，再采用植物组织DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取药材总DNA。 　　PCR扩增：ITS2正向引物ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′），反向引物ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′），反应体系25 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板2～3 μL，其余体积以ddH2O补充。反应条件为94 ℃变性5 min；再进行40个循环的94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；最后72 ℃延伸10 min[23]。 　　PCR产物取4 μL，以0.5×TBE为电泳缓冲液进行凝胶电泳，成功扩增的产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序。 　　测序峰图使用CodonCode AlignerV 3.7.1进行质量校对与拼接，将所得序列基于隐马尔科夫模型的HMMer注释方法在ITS2 database网