Race的方法克隆云芝免疫调节蛋白基因.docVIP

Race的方法克隆云芝免疫调节蛋白基因 　　摘 要：云芝是非常具有应用前景的药用真菌，但是目前关于真菌免疫调节蛋白基因克隆的方法还较少，因此本研究以云芝菌丝体为研究材料，通过Race方法从云芝中克隆出云芝免疫调节蛋白基因，并获得了云芝基因的全序列，通过本研究，以期为药用真菌的克隆方法提供有价值的参考。 　　关键词：race；免疫调节蛋白基因；克隆 　　中图分类号： Q939.5 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160931005 　　云芝是最具药用价值的真菌之一。其又被称为白芝或彩绒革盖菌，在分类学上属于真菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、云芝属。最新的研究表明，云芝中主要活性成分除了云芝多糖，云芝免疫调节蛋白也发挥了重要的作用。真菌免疫调节蛋白是小分子蛋白质，来源于高等担子菌的子实体，能够抗过敏反应、加强核酸和蛋白质的合成、提高淋转效率、提高机体的免疫功能。随着对真菌生物功能蛋白研究的日益深入，真菌免疫调节蛋白已成为学者研究的重点内容。 　　基于以上，本研究采取race方法，从云芝中克隆出云芝免疫调节蛋白，为真菌免疫调节蛋白基因克隆的研究提供新的方法。为进一步开发真菌资源提供基础的研究数据。 　　1 实验材料和试剂 　　1.1 实验材料 　　云芝（Coriolus versicolor），购自于吉林农业大学菌物研究所。 　　1.2 菌种 　　细菌菌株 E.coli DH5α为本实验室保存。 　　1.3 实验试剂 　　DNA Marker等购自于大连宝生生物有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯。 　　1.4 培养基 　　YPG培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，葡萄糖 20g/L（或麦芽糖15g/L），MgSO40.5g/L，KH2PO41g/L。配制固体培养基时加琼脂粉15g/L。110℃高压灭菌30min。 　　2 实验方法 　　2.1 云芝菌丝体的培养 　　在无菌条件下，将云芝菌种用接种针挑取一小块菌丝体接种于液体YPG培养基中，在25℃培养箱中震荡培养5～7d。 　　2.2 云芝免疫调节蛋白基因的克隆和表达载体的构建 　　2.2.1 云芝基因组总RNA提取 　　无菌水洗菌丝体，用液氮预冷研钵，在液氮中研磨菌丝体至细粉状，转入1.5mL离心管中，加入500μL提取液； 　　继续加入1mlRNAisoReagent； 　　将上述研磨好的粉末加入以上离心管中，轻轻混匀，离心（12000rpm，5min）； 　　吸取上清，放入一个新的离心管中，向其中加入200μL氯仿，混匀，离心（12000rpm， 15min）； 　　吸取上清，加入等体积异丙醇，充分混匀，在15～30℃静置20min，离心（12000rpm，10min）； 　　弃上清，加入1mL75%的乙醇，上下颠倒，12000rpm，离心（12000rpm， 5min）弃乙醇； 　　干燥沉淀2～5min（室温），加入50μL的RNase-free水使 RNA完全溶解，置于-80℃保存备用。 　　2.2.2 云芝免疫调节蛋白（Fip-cve）基因的克隆 　　2.2.2.1 中间片断的获得： 　　以赤灵芝（G.lucidum）Fip-glu基因序列（GenBank No：M58032）为基础，设计同源引物P1和P2，来完成云芝同源区域中间片断的克隆。引物序列为： 　　P1：5’TGACCGACAAGGCGTACACGTAC’3 　　P2： 5’acctggatcgtgttcgtgtccg’3 　　反转录反应体系：10μL体系，1.0μL dNTP，0.5μL Primer oligodT，0.25μL RNase inhibitor，1μL10×RT Buffer，2.75μLRNase Free H2O，2μL MgCl2，2μL RNAsample 0.5μL AMV。 　　程序为：30℃10 min，42℃30min，99℃5min。 　　PCR反应体系：50μL体系，包括0.25μLTaq酶，5μL PCR buffer，1μL dNTP（2.5 nmol/L），1μL引物A（20 nmol/μL），1μL引物B（20 nmol/μL），模板DNA 1.5μL，ddH2O 40.25μL。 　　反应程序为：（94℃预变性5min，94℃10s，55℃ 20s，72℃30s，共31个循环， 然后72℃5min）。凝胶回收扩增产物，将产物连接于pMD18-T载体，转化大肠杆菌，提取质粒后测序用于下一步。 　　2.2.2.2 3’ RACE程序 　　根据上述片断的测序结果，设计上游引物P3，用于3’ RACE，引物序列为：P3 ：5、ACCTCGGTGTG